Ba métabolites immunomodulateurs ezali eloko ya ntina ya microenvironnement ya tumeur (TME), kasi longola kaka mwa ba exceptions, identités na yango etikali mingi mingi eyebani te. Awa, to analyser ba tumeurs na ba cellules T oyo ewutaki na ba tumeurs na ba ascites ya ba malades oyo baza na carcinome sérous ya grade ya likolo (HGSC) pona ko dévoiler métabolome ya ba compartiments oyo ya TME différents. Ascite mpe baselile ya tumor ezali na bokeseni monene ya ba métabolites. Soki tokokanisi yango na ascite, baselile T oyo ekɔtaka na tumor ezali mingi na 1-méthylnicotinamide (MNA). Atako nivo ya MNA na baselile T emati, expression ya nicotinamide N-méthyltransférase (enzyme oyo e catalyser transfert ya ba groupes méthyliques depuis S-adénosylméthionine na nicotinamide) ezali limité na ba fibroblastes mpe ba cellules ya tumeur. Na mosala, MNA etindaka baselile T ebimisa cytokine oyo ekómisaka tumor, facteur de nécrose tumeur alpha. Yango wana, MNA oyo euti na TME esalaka ete baselile T ebongola nzoto mpe ezali komonisa eloko oyo ekoki kozala cible ya immunothérapie mpo na kosalisa kanser ya moto.
Ba métabolites oyo euti na tumeur ekoki kozala na effet ya kopekisa makasi na immunité anti-tumor, mpe bilembeteli mingi ezali kolakisa ete ekoki mpe kozala nguya ya ntina mpo na bokoli ya bokono (1). Longola effet Warburg, mosala oyo euti kosalema kala mingi te ebandi ko caractériser état métabolique ya ba cellules ya tumeur mpe relation na yango na état immunitaire ya microenvironnement ya tumeur (TME). Boyekoli oyo esalemaki na ba modèles ya soso mpe ba cellules T ya moto emonisi ete métabolisme ya glutamine (2), métabolisme oxidatif (3) mpe métabolisme ya glucose (4) ekoki kosala na lipanda na ba sous-groupes ndenge na ndenge ya ba cellules immunitaires. Ba métabolites mingi oyo ezali na banzela yango epekisaka baselile T esalaka anti-tumoire. Emonani ete blocage ya coenzyme tétrahydrobioptérine (BH4) ekoki kobebisa prolifération ya ba cellules T, mpe bomati ya BH4 na nzoto ekoki ko améliorer réponse immunitaire anti-tumoire médiée par CD4 na CD8. Longola yango, ekoki kobikisa effet immunosuppresseur ya kynurénine na kopesama BH4 (5). Na glioblastome mutant isocitrate déshydrogénase (IDH), sécrétion ya enantiométabolique (R)-2-hydroxyglutarate (R-2-HG) epekisaka activation ya ba cellules T, prolifération mpe Activité ya cytolyse (6). Kala mingi te, emonisami ete méthylglyoxal, produit secondaire ya glycolyse, esalemaka na ba cellules suppresseurs ya origine myéloïde, mpe transfert ya ba cellules T ya méthylglyoxal ekoki kopekisa fonctionnement ya ba cellules T effectrices. Na traitement, neutralisation ya méthylglyoxal ekoki kolonga activité ya ba cellules suppresseurs dérivées na myéloïde (MDSC) mpe ko améliorer synergiquement traitement ya blocage ya point de contrôle na ba modèles ya soso (7). Ba études oyo collectivement ezo souligner rôle clé ya ba métabolites dérivés na TME na régulation ya fonctionnement na activité ya ba cellules T.
Bato mingi balobaka ete baselile T esalaka malamu te na kanser ya ovɛrɛ (8). Yango euti na ndambo na bizaleli ya métabolisme oyo ezalaka na hypoxie mpe na misisa ya tumor oyo ezali malamu te (9), oyo esalaka ete glucose mpe tryptophane ebongwana biloko oyo ekoki kobima lokola acide lactique mpe kynurénine. Lactate extracellulaire eleki ndelo ekitisaka production ya interféron-γ (IFN-γ) mpe e diriger différenciation ya ba sous-groupes myélosuppresseurs ( 10 , 11 ). Kolya tryptophane epekisaka mbala moko prolifération ya ba cellules T mpe epekisaka signalisation ya récepteur ya ba cellules T ( 12-14 ). Malgré ba observations oyo, mosala mingi zinga zinga ya métabolisme immunitaire esalemaki in vitro culture ya ba cellules T in vitro en utilisant ba milieu optimisés, to limité na ba modèles ya soso homologues in vivo, moko te na yango ezo refleter entièrement hétérogénéité ya ba cancers ya batu na environnement macro na micro Physiologique.
Eloko oyo emonanaka mingi na kanser ya ovaires ezali kopalangana na péritonéal mpe komonana ya ascite. Koyangana ya mai ya baselile na ascite ezali na boyokani na maladi oyo ekómi makasi mpe pronostic ya mabe ( 15 ). Engebene balapolo, eteni wana oyo ekeseni na mosusu nyonso ezali na hypoxique, ezali na nivo monene ya facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) mpe indoléamine 2,3-dioxygénase (IDO), mpe ekɔtisami na baselile T oyo etambwisaka makambo mpe baselile oyo epekisaka myéloïde ( 15-18 ). Environnement métabolique ya ascite ekoki kokesana na oyo ya tumeur yango moko, yango wana reprogrammation ya ba cellules T na espace péritonéal ezali clair te. En plus, bokeseni ya ntina mpe hétérogénéité entre ascite na ba métabolites oyo ezali na environnement ya tumeur ekoki kopekisa infiltration ya ba cellules immunitaires mpe fonctionnement na yango na ba tumeurs, mpe bolukiluki mosusu esengeli.
Pona ko résoudre ba problèmes wana, to conçu méthode ya séparation cellulaire sensible na chromatographie liquide tandem spectrométrie de masse (LC-MS/MS) pona koyekola ba types ya ba cellules différentes (y compris ba cellules T CD4 + na CD8 +) ainsi que na kati pe entre ba tumeurs Ba métabolites na yango ezo span ba cellules na même environnement ya ascite na tumeur ya malade. Tosalelaka méthode oyo en conjonction na cytométrie ya écoulement haute dimension mpe séquençage ya ARN ya cellule unique (scRNA-seq) mpo na kopesa portrait très résolution ya état métabolique ya ba populations clés wana. Méthode oyo emonisaki bomati monene ya niveau ya 1-méthylnicotinamide (MNA) na ba cellules T ya tumeur, mpe ba expériences in vitro elakisaki que effet immunomodulateur ya MNA na fonctionnement ya ba cellules T eyebanaki te. En général, méthode oyo emonisaka ba interactions métaboliques mutuelles entre ba tumeurs na ba cellules immunitaires, mpe epesaka ba insights unique na ba métabolites ya régulation immunitaire, oyo ekoki kozala na tina pona traitement ya immunothérapie ya cancer ya ovaire basé na ba cellules T Mabaku ya traitement.
Tosalelaki cytométrie ya écoulement haute dimension mpo na ko quantifier en même temps absorption ya glucose [2-(N-(7-nitrophényl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-déoxyglucose (2-NBDG) mpe activité mitochondriale [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) ezali côté à côté typique ba marqueurs oyo ekesenisaka ba cellules immunitaires mpe ba populations ya ba cellules tumeur (Tableau S2 mpe Figure S1A). Analyse oyo elakisaki que soki tokokanisi yango na ba cellules T, ba cellules ya ascite na tumor ezali na niveau ya absorption ya glucose ya likolo, kasi ezali na ba différences ya mike na activité mitochondriale. Mwayene ya bozui ya glucose ya ba cellules ya tumeur [CD45-EpCAM (EpCAM)+] ezali mbala misato to minei koleka ya ba cellules T, mpe mwayene ya bozui ya glucose ya ba cellules T CD4 + ezali mbala 1,2 koleka ya ba cellules T CD8 +, oyo elakisi ete ba lymphocytes infiltrants ya tumeur (TIL) ezali na ba besoins métaboliques ekeseni ata na TME moko (Figure 1A). Na bokeseni, mosala ya mitochondrial na ba cellules ya tumeur ekokani na oyo ya ba cellules T CD4 +, mpe activité mitochondriale ya ba types nionso mibale ya ba cellules eleki oyo ya ba cellules T CD8 + (Figure 1B). En général, ba résultats oyo emonisaka niveau métabolique. Activité métabolique ya ba cellules tumorales eleki oyo ya ba cellules T CD4 +, mpe activité métabolique ya ba cellules T CD4 + ezali likolo koleka oyo ya ba cellules T CD8 +. Malgré ba effets oyo na ba types ya ba cellules, bokeseni ya constant ezali te na état métabolique ya ba cellules T CD4 + na CD8 + to proportions relatives na yango na ascites soki tokokanisi yango na ba tumeurs (Figure 1C). Na bokeseni, na fraction ya ba cellules CD45, proportion ya ba cellules EpCAM+ na tumeur emati soki tokokanisi yango na ascite (Figure 1D). Tomonaki mpe bokeseni ya polele ya métabolisme kati na biloko ya baselile EpCAM+ mpe EpCAM-. Ba cellules EpCAM+ (tumor) ezali na absorption ya glucose mpe activité mitochondriale ya likolo koleka ba cellules EpCAM-, oyo ezali mingi koleka activité métabolique ya ba fibroblastes na ba cellules ya tumeur na TME (Figure 1, E et F).
. (C) Rapport ya ba cellules CD4 + na CD8 + (ya ba cellules T CD3 +) na ascite na tumeur. (D) Proportion ya ba cellules ya tumeur EpCAM + na ascite na tumeur (CD45−). (E mpe F) EpCAM + CD45-tumor mpe EpCAM-CD45-matrix glucose absorption (2-NBDG) (E) mpe activité mitochondriale (MitoTracker rouge foncé) (F) graphiques représentants (gauche) mpe ba données tabulées ( Droite) Ascite mpe ba cellules ya tumeur. (G) Ba graphes représentants ya expression ya CD25, CD137 na PD1 na cytométrie ya flux. (H mpe I) Expression ya CD25, CD137 mpe PD1 na ba cellules T CD4 + (H) mpe ba cellules T CD8 + (I). (J na K) Ba phénotypes naïf, mémoire centrale (Tcm), effecteur (Teff) na mémoire effecteur (Tem) oyo esalemi na expression ya CCR7 na CD45RO. Ba images représentantes (gauche) na ba données tabulaire (droite) ya ba cellules T CD4 + (J) na ba cellules T CD8 + (K) na ascite na ba tumeurs. Ba valeurs ya P oyo ezuami na t-test ya mibale (*P<0.05, **P<0.01 mpe ***P<0.001). Line ezali komonisa ba malades oyo ekokani (n = 6). FMO, fluorescence moins moko; MFI, intensité médiane ya fluorescence.
Analyse mosusu emonisaki bokeseni mosusu ya ntina kati na ezalela ya phénotype ya ba cellules T oyo esili mingi. Mémoire activée (Figure 1, G à I) mpe effecteur (Figure 1, J mpe K) na ba tumeurs ezali mingi koleka ascite (proportion ya ba cellules T CD3 +). Ndenge moko mpe, ko analyser phénotype na expression ya ba marqueurs ya activation (CD25 na CD137) na ba marqueurs ya dépletion [protéine ya liwa ya ba cellules programmées 1 (PD1)] elakisaki que atako ba caractéristiques métaboliques ya ba populations wana ekeseni (Figure S1, B à E) , Kasi ba différences métaboliques ya significatives emonanaki constamment te entre ba sous-ensembles naïfs, effecteurs to mémoires (Figure S1, F à I). Ba résultats oyo endimami na kosalelaka ba méthodes ya apprentissage machine mpo na ko assigner automatiquement ba phénotypes ya ba cellules (21), oyo emonisaki lisusu présence ya nombre monene ya ba cellules ya moelle osseuse (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) na ascite ya malade (Figure S2A ). Na kati ya mitindo nyonso ya baselile oyo emonisami, population oyo ya ba cellules myéloïdes elakisaki absorption ya glucose mingi mpe activité mitochondriale (Figure S2, B à G). Ba résultats oyo ezo souligner ba différences métaboliques makasi entre ba types ya ba cellules multiples oyo ezwami na ascite na ba tumeurs na ba malades ya HGSC.
Mokakatano monene mpo na kososola bizaleli ya métabonomique ya TIL ezali bosenga ya kokabola ba échantillons ya ba cellules T ya bopeto, qualité mpe quantité ekoki na ba tumeurs. Ba études ya sika elakisaki que ba méthodes ya triage na enrichissement ya perles oyo esalemi na cytométrie ya flux ekoki komema ba changements na ba profils ya ba métabolites cellulaires ( 22-24 ). Pona kolonga problème oyo, to optimiser méthode ya enrichissement ya perles pona ko isoler pe ko isoler TIL na cancer ya ovaires humain résecté na chirurgie avant ya analyse na LC-MS/MS (tala Matériaux et Méthodes; Figure 2A). Pona ko évaluer impact global ya protocole oyo na ba changements ya ba métabolites, tokokanisaki ba profils métabolites ya ba cellules T activées na ba donateurs santé sima ya étape ya séparation ya perles oyo tolobeli likolo na ba cellules oyo ekabwanaki na perles te kasi etikalaki na glace. Analyse oyo ya contrôle ya qualité emoni ete ezali na corrélation ya likolo entre ba conditions oyo mibale (r = 0,77), mpe répétabilité technique ya groupe ya 86 métabolites ezali na répétabilité ya likolo (Figure 2B). Na yango, ba méthodes oyo ekoki kosala analyse ya sikisiki ya ba métabolites na ba cellules oyo ezali kosala enrichissement ya type cellulaire, na ndenge wana kopesa plateforme ya liboso ya haute résolution mpo na koyeba ba métabolites spécifiques na HGSC, na yango ko permettre batu bazua compréhension profonde ya spécificité ya ba cellules Programme ya métabolisme sexuel.
(A) Schéma schématique ya enrichissement ya perle magnétique. Yambo ya kosala analize na LC-MS/MS, ba cellules ekosala ba tour misato oyo elandi ya enrichissement ya perles magnétiques to ekotikala na glace. (B) Effet ya type ya enrichissement na ebele ya ba métabolites. Mwayene ya ba mesures misato pona lolenge moko moko ya enrichissement ± SE. Molongo ya mpɛmbɛ ezali komonisa boyokani ya 1:1. Corrélation intra-classe (ICC) ya ba mesures répétitives oyo elakisami na étiquette ya axe. NAD, nicotinamide adénine dinucléotide. (C) Schéma schématique ya flux ya mosala ya analyse ya ba métabolites ya maladi. Bazwaka ascite to ba tumeurs epai ya bato ya maladi mpe babombaka yango na cryopre. Eteni moke ya échantillon moko na moko e analysé na cytométrie ya flux, nzoka nde ba échantillons oyo etikali esalemaki na ba tour misato ya enrichissement pona ba cellules CD4+, CD8+ na CD45-. Ba fractions cellules wana e analysé na nzela ya LC-MS/MS. (D) Carte ya molunge ya ebele ya ba métabolites standardisées. Dendrogramme ezali komonisa bosangisi ya Ward ya ba distances euclidiennes kati ya ba échantillons. (E) Analyse ya composante principale (PCA) ya carte ya métabolite ya échantillon, oyo ezali kolakisa ba réplicas misato ya échantillon moko na moko, ba échantillons ya malade moko ekangami na ligne. (F) PCA ya profil métabolite ya échantillon conditionné na malade (c.a.d., kosalela redundance partielle); lolenge ya échantillon ezali na ndelo na coque convexe. PC1, eteni monene 1; PC2, eteni monene 2.
Na sima, tosalelaki méthode oyo ya enrichissement pona ko analyser ba métabolites 99 na ba fractions ya ba cellules CD4 +, CD8 + na CD45 na ba ascites primaires na ba tumeurs ya ba malades motoba ya HGSC (Figure 2C, Figure S3A na Tableau S3 na S4). Population ya intérêt ezali na 2% à 70% ya échantillon monene ya ebandeli ya ba cellules vivantes, mpe proportion ya ba cellules ekeseni mingi entre ba malades. Sima ya kokabola ba perles, fraction enrichie ya intérêt (CD4+, CD8+ to CD45-) ezali koleka 85% ya ba cellules vivantes nionso na échantillon na moyenne. Méthode oyo ya enrichissement epesaka biso nzela ya ko analyser ba populations ya ba cellules à partir ya métabolisme ya tissus ya tumeur ya moto, oyo ekoki kosalema te na ba échantillons ya minene. Na kosalelaka protocole oyo, to déterminer que l-kynurénine na adénosine, ba métabolites immunosuppresseurs oyo mibale oyo ezali bien caractérisé ezalaki elevé na ba cellules T ya tumeur to ba cellules ya tumeur (Figure S3, B et C). Na yango, ba résultats oyo ezali kolakisa fidélité mpe makoki ya technologie na biso ya séparation cellulaire mpe ya spectrométrie de masse mpo na koluka ba métabolites biologiquement importants na ba tissus ya maladi.
Analyse na biso emonisaki pe separation métabolique makasi ya ba types ya ba cellules na kati pe entre ba malades (Figure 2D na Figure S4A). Mingimingi, soki tokokanisi yango na ba maladi mosusu, mobɛli 70 amonisaki bizaleli ya métabolisme ekeseni (Figure 2E mpe Figure S4B), oyo emonisi ete ekoki kozala na hétérogénéité métabolique ya monene kati na ba maladi. Ezali na ntina koyeba ete soki tokokanisi yango na ba maladi mosusu (1,2 kino 2 litres; Tableau S1), motango mobimba ya ascite oyo ezwamaki na mobeli 70 (80 ml) ezalaki moke. Contrôle ya hétérogénéité inter-maladie na tango ya analyse ya composante principale (par exemple, en utilisant analyse partielle de redundance) elakisaka ba changements constants entre ba types ya ba cellules, mpe ba types ya ba cellules mpe/to microenvironnement esangisi polele selon profil ya ba métabolites (Figure 2F ). Analyse ya ba métabolites unique e soulignaki ba effets wana mpe emonisaki bokeseni ya monene entre ba types ya ba cellules na microenvironnement. Ezali na ntina koyeba ete bokeseni oyo eleki ndelo oyo emonanaka ezali MNA, oyo mbala mingi ekómaka mingi na baselile CD45- mpe na baselile CD4+ mpe CD8+ oyo ekɔtaka na tumor (Figure 3A). Mpo na ba cellules CD4 +, effet oyo ezali komonana mingi, mpe MNA na ba cellules CD8 + emonani mpe kozala na bopusi makasi na environnement. Kasi, yango ezali na ntina te, mpo kaka misato kati na ba maladi motoba nde bakoki kotalelama mpo na ba scores ya CD8+ ya tumeur. Longola MNA, na mitindo ndenge na ndenge ya baselile na ascite mpe na ba tumeurs, ba métabolites mosusu oyo ezali na bizaleli malamu te na TIL ezali mpe na bomengo ekeseni (Figures S3 mpe S4). Yango wana, ba données oyo emonisaka ensemble ya ba métabolites immunomodulateurs oyo ezali kopesa elikya mpo na bolukiluki mosusu.
(A) Contenu normalisé ya MNA na ba cellules CD4+, CD8+ na CD45- oyo ewutaka na ascite na tumeur. Graphique ya boîte ezali kolakisa médiane (ligne), interquartile (charnière ya cadre) pe intervalle ya ba données, kino mbala 1,5 ya interquartile (mipepe ya cadre). Ndenge elobami na Biloko mpe mayele ya mobeli, salelá motuya ya limma ya mobɛli mpo na koyeba motuya ya P (*P<0.05 mpe **P<0.01). (B) Schéma schématique ya métabolisme ya MNA (60). Ba métabolites: S-adénosyl-1-méthionine; SAH, S-adénosine-1-homocystéine oyo ezali na kati; NA, nicotinamide, oyo babengi nicotinamide; MNA, 1-méthylnicotinamide oyo ezali na kati; 2-PY, 1-méthyl- 2-pyridone-5-carboxamide oyo ezali na kati; 4-PY, 1-méthyl-4-pyridone-5-carboxamide oyo ezali na kati; NR, ribose ya nicotinamide; NMN, mononucléotide ya nicotinamide. Ba enzymes (vert): NNMT, nicotinamide N-méthyltransférase; SIRT, ba sirtuins, ba sirtuins; NAMPT, nicotinamide phosphoribosyl transferase, oyo ezali na phosphoribosyl transferase; AOX1, aldéhyde oxydase 1, oyo ezali na kati; NRK, nicotinamide riboside kinase, oyo ezali na nicotinamide; NMNAT, nicotinamide mono Nucléotide adénylate transferase; Pnp1, phosphorylase ya nucléoside ya purine. (C) t-SNE ya scRNA-seq ya ascite (gris) mpe tumeur (rouge; n = 3 malades). (D) Expression ya NNMT na ba populations ya ba cellules différentes oyo ezuami na nzela ya scRNA-seq. (E) Expression ya NNMT na AOX1 na SK-OV-3, rein embryon ya moto (HEK) 293T, ba cellules T na ba cellules T traitées na MNA. Expression pliée elakisami par rapport na SK-OV-3. Modèle ya expression na SEM elakisami (n = 6 donateurs santé). Ba valeurs ya Ct oyo eleki 35 etalelami lokola oyo ekoki komonana te (UD). (F) Expression ya SLC22A1 na SLC22A2 na SK-OV-3, HEK293T, ba cellules T na ba cellules T oyo esalemi na 8mM MNA. Expression pliée elakisami par rapport na SK-OV-3. Modèle ya expression na SEM elakisami (n = 6 donateurs santé). Ba valeurs ya Ct oyo eleki 35 etalelami lokola oyo ekoki komonana te (UD). (G) Contenu ya MNA ya ba cellules na ba cellules T donneuses ya santé activées sima ya 72 heures ya incubation na MNA. Modèle ya expression na SEM elakisami (n = 4 donateurs santé).
MNA esalemaka na ko transférer groupe méthyl depuis S-adénosyl-1-méthionine (SAM) na nicotinamide (NA) na nicotinamide N-méthyltransférase (NNMT; Figure 3B). NNMT ezali koleka ndelo na ba cancers ndenge na ndenge ya bato mpe ezali na boyokani na prolifération, invasion mpe métastases (25-27). Mpo na kososola malamu source ya MNA na ba cellules T na TME, tosalelaki scRNA-seq mpo na ko caractériser expression ya NNMT na ba types ya ba cellules na ba ascites mpe ba tumeurs ya ba malades misato ya HGSC ( Tableau S5 ). Analyse ya soki 6.500 cellules elakisaki que na ba environnements ya ascites na tumeur, expression ya NNMT ezalaki restreint na ba populations présumées ya fibroblastes na ya ba cellules tumeur (Figure 3, C et D). Ezali na ntina koyeba ete ezali na expression ya NNMT ya polele te na population moko te oyo e exprimaka PTPRC (CD45 +) (Figure 3D mpe Figure S5A), oyo ezali kolakisa ete MNA oyo ezwami na spectre ya ba métabolites ekotisami na ba cellules T. Expression ya aldehyde oxidase 1 (AOX1) ebongoli MNA na 1-méthyl-2-pyridone-5-carboxamide (2-PYR) to 1-méthyl-4-pyridone-5-carboxamide (4- PYR); Figure 3B) ezali pe restreint na population ya ba fibroblastes oyo e exprimaka COL1A1 (Figure S5A), oyo elongo elakisaka que ba cellules T ezangi makoki ya métabolisme ya MNA conventionnel. Modèle ya expression ya ba gènes oyo etali MNA e vérifié en utilisant deuxième ensemble ya ba données cellules indépendantes oyo ewutaki na ba ascites ewutaki na ba malades ya HGSC (Figure S5B; n = 6) (16). En plus, analyse quantitative ya réaction en chaîne polymérase (qPCR) ya ba cellules T donneuses ya santé oyo e traité na MNA elakisaki que par rapport na ba cellules tumorales ya ovaire SK-OV-3 témoin, NNMT to AOX1 ezalaki presque exprimé te (Figure 3E). Ba résultats oyo ekanisamaki te ezali kolakisa que MNA ekoki kobima na ba fibroblastes to ba tumeurs na ba cellules T oyo ezali pembeni na TME.
Atako ba candidats ezali na libota ya ba transporteurs organiques 1 à 3 (OCT1, OCT2 mpe OCT3) codé na famille ya porteur soluble 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 mpe SLC22A3), ba transporteurs potentiels ya MNA ezali nanu défini te (28) . QPCR ya ARNm oyo ewutaki na ba cellules T donneuses ya santé elakisaki niveau ya expression ya SLC22A1 ya nse kasi niveau indetectable ya SLC22A2, oyo e confirmaki que elobamaki liboso na ba livres (Figure 3F) (29). Na bokeseni, ligne cellulaire ya tumeur ovaire SK-OV-3 e exprimaki niveau ya likolo ya ba transporteurs nionso mibale (Figure 3F).
Mpo na komeka likoki ya ete baselile T ezala na likoki ya kozwa MNA ya bapaya, bakómisaki baselile T oyo epesi nzoto kolɔngɔnɔ na boumeli ya ngonga 72 na miso ya ba concentrations ekeseni ya MNA. Na absence ya MNA exogène, contenus cellulaires ya MNA ekoki ko détecté te (Figure 3G). Kasi, ba cellules T activées oyo e traité na MNA exogène elakisaki augmentation dépendante ya dose ya teneur ya MNA na ba cellules, jusqu’à 6 mM MNA (Figure 3G). Résultat oyo ezali kolakisa que malgré niveau ya expression ya transporteur ya nse mpe manque ya enzyme principale responsable ya métabolisme intracellulaire ya MNA, TIL ekoki kaka kozua MNA.
Spectre ya ba métabolites na ba cellules T ya ba malades mpe ba expériences ya absorption ya MNA in vitro ematisaka possibilité que ba fibroblastes associés na cancer (CAF) e secréter MNA mpe ba cellules ya tumeur ekoki ko réguler phénotype mpe fonctionnement ya TIL. Mpo na koyeba effet ya MNA na ba cellules T, ba cellules T donantes ya santé e activer in vitro na présence to absence ya MNA, mpe prolifération na yango mpe production ya cytokines e évaluer. Sima ya mikolo 7 ya kobakisa MNA na dose ya likolo, motango ya doublement ya population ekitisami na moyenne, alors que vigor esimbamaki na ba dose nionso (Figure 4A). En plus, traitement ya MNA exogène esali que proportion ya ba cellules T CD4 + na CD8 + oyo e exprimaka facteur ya nécrose tumeur-α (TNFα; Figure 4B) emata. Na bokeseni, bokeli ya IFN-γ na kati ya baselile ekitisama mingi na ba cellules T CD4 +, kasi na ba cellules T CD8 + te, mpe mbongwana ya monene ezalaki te na interleukine 2 (IL-2; Figure 4, C mpe D). Na yango, test immunosorbant lié en enzyme (ELISA) ya ba supernatants oyo ewutaki na ba cultures oyo ya ba cellules T traitées na MNA elakisaki bomati ya makasi ya TNFα, bokiti ya IFN-γ, mpe mbongwana ya IL-2 te (Figure 4, E à G). . Bokiti ya IFN-γ emonisi ete MNA ekoki kosala mosala mpo na kopekisa mosala ya kobundisa tumor ya baselile T. Pona ko simuler effet ya MNA na cytotoxicité médiée par ba cellules T, ba cellules chimériques réceptrice antigène T (FRα-CAR-T) oyo etali ba cellules ya récepteur folate α na CAR-T (GFP) régulé na ba cellules ya proteine ​​fluorescente vert (GFP) -CAR-T) esalemi na ba cellules mononucléaires périphériques ya makila (PBMC) oyo ezali na nzoto kolɔngɔnɔ. Ba cellules CAR-T e cultivé pendant 24 heures en présence ya MNA, et puis e co-culturé na ba cellules ya tumeur ovaire SK-OV-3 ya moto oyo e exprimaka récepteur folate α na rapport effecteur na cible ya 10:1. Traitement ya MNA esalaki que activité ya koboma ya ba cellules FRα-CAR-T ekita makasi, oyo ekokanaki na ba cellules FRα-CAR-T oyo e traité na adénosine (Figure 4H).
(A) Total ya motango ya ba cellules viable mpe doublement ya population (PD) directement à partir ya culture na mokolo ya 7. Graphique à barres ezali komonisa moyenne + SEM ya ba donateurs motoba ya santé. Ezali komonisa ba données oyo ewutaki au moins n = 3 expériences indépendantes. (B à D) CD3/CD28 mpe IL-2 esalelamaki mpo na ko activer ba cellules T na ba concentrations na yango ya MNA na boumeli ya mikolo 7. Yambo ya analyse, ba cellules e stimuler na PMA/ionomycine na GolgiStop pendant 4 heures. Expression ya TNFα (B) na ba cellules T. Ndakisa ya elilingi (na gauche) mpe ba données tabulaire (na droite) ya expression ya TNFα na ba cellules vivantes. Expression ya IFN-γ (C) mpe IL-2 (D) na ba cellules T. Expression ya ba cytokines e mezamaki na cytométrie ya flux. Graphique à barres ezali komonisa moyenne (n = 6 donateurs santé) + SEM. Salelá botangi ya bokeseni na nzela moko mpe ba mesures oyo ezongelami (*P<0.05 mpe **P<0.01) mpo na koyeba motuya ya P. Ezali komonisa ba données oyo ewutaki au moins n = 3 expériences indépendantes. (E à G) CD3/CD28 mpe IL-2 esalelamaki mpo na ko activer ba cellules T na ba concentrations na yango ya MNA na boumeli ya mikolo 7. Bazwaki milieu liboso mpe nsima ya ngonga 4 ya stimulation ya PMA/ionomycine. Ba concentrations ya TNFα (E), IFN-γ (F) na IL-2 (G) e mezamaki na ELISA. Graphique à barres ezali komonisa moyenne (n = 5 donateurs santé) + SEM. Valeur P oyo ezuami na kosalelaka analyse ya variance na nzela moko pe ba mesures répétitives (*P<0.05). Line ya ba points elakisi ndelo ya détection ya détection. (H) Test ya lyse cellulaire. Ba cellules FRα-CAR-T to GFP-CAR-T ebongisamaki na adénosine (250μM) to MNA (10 mM) na boumeli ya ngonga 24, to etikamaki kozanga lisalisi (Ctrl). Bamekaki motángo ya baselile ya SK-OV-3 oyo ebomamaki na ba pourcentages. Valeur P oyo ezuami na test t ya Welch (*P<0.5 na **P<0.01).
Pona kozua compréhension mécanique ya régulation ya expression ya TNFα dépendante ya MNA, ba changements ya mRNA ya TNFα ya ba cellules T traitées na MNA e évaluer (Figure 5A). Ba cellules T donneuses ya santé oyo esalemi na MNA elakisaki bomati ya mbala mibale ya niveau ya transcription ya TNFα, elakisaka que MNA ezali dépendant na régulation ya transcription ya TNFα. Mpo na koluka koyeba mécanisme régulateur oyo ekoki kozala, ba facteurs mibale oyo eyebani ya transcription oyo e régulaka TNFα, elingi koloba facteur nucléaire ya ba cellules T activées (NFAT) mpe proteine ​​1 spécifique (Sp1), evaluer na réponse ya liaison ya MNA na promoteur proximal ya TNFα ( 30 ). Promoteur ya TNFα ezali na ba sites 6 identifiés ya liaison ya NFAT mpe ba sites 2 ya liaison ya Sp1, oyo ezo superposer na site moko [-55 paires de bases (bp) à partir ya 5'cap] (30). Immunoprecipitation ya chromatine (ChIP) emonisaki ete ntango basalisaki yango na MNA, bokangami ya Sp1 na promoteur ya TNFα ebakisami mbala misato. Bokotisi ya NFAT mpe emati mpe epusanaki penepene na ntina (Figure 5B). Ba données oyo ezo lakisa que MNA ezo réguler expression ya TNFα na nzela ya transcription ya Sp1, pe na moins cher expression ya NFAT.
(A) Soki tokokanisi yango na ba cellules T oyo ekolisami sans MNA, changement ya pli ya expression ya TNFα na ba cellules T oyo esalemi na MNA. Modèle ya expression na SEM elakisami (n = 5 donateurs santé). Ezali komonisa ba données oyo ewutaki au moins n = 3 expériences indépendantes. (B) Promoteur ya TNFα ya ba cellules T oyo e traité na to sans 8 mM MNA sima ya NFAT na Sp1 esangisamaki na (Ctrl) na stimulation ya PMA/ionomycine pendant 4 heures. Immunoglobuline G (IgG) mpe H3 esalelamaki lokola ba contrôles négatifs mpe positifs mpo na immunoprécipitation, respectivement. Quantification ya ChIP elakisaki que liaison ya Sp1 na NFAT na promoteur ya TNFα na ba cellules traitées na MNA emati mbala ebele soki tokokanisi yango na témoin. Ezali komonisa ba données oyo ewutaki au moins n = 3 expériences indépendantes. Valeur P oyo ezuami na ba t-tests ebele (*** P <0.01). (C) Soki tokokanisi yango na ba ascites ya HGSC, ba cellules T (oyo ezali cytotoxiques te) emonisaki bomati ya expression ya TNF na tumeur. Ba couleurs ezali komonisa ba malades ndenge na ndenge. Ba cellules oyo elakisami ezuami na échantillonnage au hasard na 300 mpe e jittered pona ko limiter surtraction (** Padj = 0.0076). (D) Modèle oyo esengami ya MNA mpo na cancer ya ovaires. MNA esalemaka na baselile ya tumor mpe na ba fibroblastes na TME mpe ezwamaka na baselile T. MNA ematisaka bokangami ya Sp1 na promoteur ya TNFα, ememaka na bomati ya transcription ya TNFα mpe production ya cytokines ya TNFα. MNA esalaka mpe ete IFN-γ ekita. Kopekisa mosala ya baselile T ememaka na kokitisa makoki ya koboma mpe bokoli ya tumor nokinoki.
Engebene balapolo, TNFα ezali na ba effets anti-tumor mpe anti-tumor dépendant ya liboso mpe ya sima, kasi ezali na rôle eyebani malamu mpo na kolendisa bokoli mpe métastases ya cancer ya ovaires (31-33). Engebene balapolo, concentration ya TNFα na ascite mpe na ba tissus ya tumeur na ba malades oyo bazali na cancer ya ovaires ezali mingi koleka oyo ya ba tissus bénines ( 34-36 ). Na oyo etali mécanisme, TNFα ekoki ko réguler activation, fonctionnement mpe prolifération ya ba globules blancs, mpe ko changer phénotype ya ba cellules cancer (37, 38). Na boyokani na ba résultats oyo, analyse différentielle ya expression génétique elakisaki que TNF ezalaki significativement régulée na likolo na ba cellules T na ba tissus ya tumeur soki tokokanisi yango na ascite (Figure 5C). Bomati ya expression ya TNF emonanaki kaka na ba populations ya ba cellules T oyo ezalaki na phénotype non cytotoxique (Figure S5A). Na bokuse, ba données oyo ezali ko soutenir likanisi oyo ete MNA ezali na ba effets immunosuppresseurs doubles mpe promotion ya tumeur na HGSC.
Etiquetage fluorescent oyo esalemi na cytométrie ya flux ekomi méthode principale pona koyekola métabolisme ya TIL. Ba études oyo elakisaki que soki tokokanisi yango na ba lymphocytes périphériques ya makila to ba cellules T oyo ewutaka na ba organes lymphoïdes secondaires, TIL ya soso mpe ya moto ezali na tendance ya kozua glucose mingi ( 4 , 39 ) mpe kobungisa mokemoke fonctionnement mitochondrie ( 19 , 40 ). Atako tomoni ba résultats ya ndenge moko na études oyo, développement ya clé ezali ya ko comparer métabolisme ya ba cellules ya tumeur na TIL oyo ewutaka na tissus tumeur moko resectés. Na boyokani na mwa ndambo ya balapolo oyo ya kala, baselile ya tumeur (CD45-EpCAM +) oyo euti na ascite mpe na ba tumeurs ezali na bozui ya glucose mingi koleka ba cellules T CD8 + mpe CD4 +, oyo ezali kosunga ete bozui ya glucose mingi ya ba cellules ya tumeur ekoki kokokana na ba cellules T. Likanisi ya momekano ya baselile T. TME. Kasi, mosala ya mitochondriale ya baselile ya tumor eleki oyo ya ba cellules T CD8 +, kasi mosala ya mitochondriale ekokani na oyo ya ba cellules T CD4 +. Ba résultats oyo e renforcer thème oyo ezali kobima que métabolisme oxidatif ezali important pona ba cellules ya tumeur ( 41 , 42 ). Bazali mpe koloba ete ba cellules T CD8 + ekoki kozala na likama mingi ya dysfonctionnement oxidatif koleka ba cellules T CD4 +, to ete ba cellules T CD4 + ekoki kosalela ba sources ya carbone mosusu oyo ezali glucose te mpo na kobatela activité mitochondriale ( 43 , 44 ). Esengeli koyeba ete tomonaki bokeseni te na absorption ya glucose to na activité mitochondriale entre ba effecteurs CD4 + T, mémoire T effecteur mpe ba cellules ya mémoire centrale T na ascite. Ndenge moko mpe, état ya différenciation ya ba cellules T CD8 + na ba tumeurs ezali na rapport moko te na ba changements ya absorption ya glucose, ko souligner différence significative entre ba cellules T cultivées in vitro na TIL ya moto in vivo ( 22 ). Ba observations oyo e confirmer pe na usage ya allocation automatique ya population cellulaire sans bias, oyo emonisaki lisusu que ba cellules CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + oyo ezali na absorption ya glucose ya likolo pe activité mitochondriale koleka ba cellules tumorales ezali prévalente mais ezali na population cellulaire active Métabolique. Population oyo ekoki ko représenter sous-population présumée ya ba cellules suppresseurs myéloïdes to ba cellules dendritiques plasmacytoïdes oyo ezuami na analyse scRNA-seq. Atako oyo mibale elobami na ba tumeurs ya ovaires ya moto [45], esengeli naino Mosala mosusu ezali ya kolimbola sous-population myéloïde oyo.
Atako ba méthodes basées na cytométrie d’écoulement ekoki ko clarifier ba différences générales ya glucose na métabolisme oxidatif entre ba types ya ba cellules, ba métabolites précis oyo esalemi na glucose to ba sources mosusu ya carbone pona métabolisme mitochondrial na TME ezuami nanu te. Kopesa présence to absence ya ba métabolites na sous-ensemble moko ya TIL esengaka purification ya population cellulaire na tissus excisé. Na yango, méthode na biso ya enrichissement cellulaire esangani na spectrométrie de masse ekoki kopesa ba insights na ba métabolites oyo ezali enrichie différentiellement na ba cellules T mpe na ba populations ya ba cellules tumeur na ba échantillons ya ba malades oyo ekokani. Atako lolenge oyo ezali na matomba koleka triage ya ba cellules activées par fluorescence, ba bibliothèques mosusu ya ba métabolites ekoki kozala affectées mpo na stabilité inhérente mpe/to taux ya rotation rapide ( 22 ). Atako bongo, lolenge na biso ekokaki koyeba ba métabolites immunosuppresseurs mibale oyo eyebani, adénosine mpe kynurénine, mpo ekeseni mingi kati na mitindo ya échantillon.
Analyse métabonomique na biso ya ba tumeurs na ba sous-types ya TIL epesaka ba insights mingi na rôle ya ba métabolites na TME ya ovaires. Ya liboso, na kosaleláká cytométrie ya flux, tomonaki ete bokeseni ezalaki te na mosala ya mitochondrie kati na ba tumeurs mpe ba cellules T CD4 +. Kasi, analyse LC-MS/MS emonisaki mbongwana ya monene na ebele ya ba métabolites na kati ya ba populations wana, elakisaki ete ba conclusions oyo etali métabolisme ya TIL mpe activité métabolique na yango mobimba esengaka interprétation ya bokebi. Ya mibale, MNA ezali métabolite oyo ezali na bokeseni monene kati na ba cellules CD45 mpe ba cellules T na ascite, kasi na ba tumeurs te. Na yango, compartimentalisation mpe esika ya tumeur ekoki kozala na ba effets différents na métabolisme ya TIL, oyo ezali ko souligner hétérogénéité possible na microenvironnement moko donnée. Ya misato, expression ya enzyme NNMT oyo ebimisaka MNA ezali mingimingi na CAF, oyo ezali ba cellules ya tumeur na ndenge ya moke, kasi niveau ya MNA oyo ekoki komonana emonanaka na ba cellules T oyo euti na tumeur. Surexpression ya NNMT na CAF ya ovaires ezali na effet eyebani ya promotion ya cancer, en partie mpo na promotion ya métabolisme ya CAF, invasion ya tumeur mpe métastases ( 27 ). Atako niveau mobimba ya TIL ezali moyenne, expression ya NNMT na CAF ezali na boyokani makasi na sous-type mésenchymale ya Cancer Genome Atlas (TCGA), oyo ezali na boyokani na pronostic ya mabe ( 27 , 46 , 47 ). Na nsuka, expression ya enzyme AOX1 oyo ezali responsable ya dégradation ya MNA ezali mpe limitée na population ya CAF, oyo elakisaka que ba cellules T ezangi makoki ya ko métaboliser MNA. Ba résultats oyo ezali ko soutenir idée que atako esengeli mosala mosusu mpo na ko vérifier constat oyo, niveau ya MNA ya likolo na ba cellules T ekoki kolakisa présence ya microenvironnement CAF immunosuppresseur.
Soki totali niveau ya expression ya ba transporteurs ya MNA ya nse mpe niveau ya ba protéines clés oyo ekoki ko détecter te oyo ezo intervenir na métabolisme ya MNA, présence ya MNA na ba cellules T ezali imprévue. Ezala NNMT to AOX1 ekokaki te ko détecté na analyse scRNA-seq mpe qPCR ciblé ya deux cohortes indépendantes. Ba résultats oyo ezo lakisa que MNA esalemaka na ba cellules T te, kasi ezuami na TME oyo ezali zinga zinga. Ba expériences in vitro emonisi que ba cellules T ezalaka na tendance ya ko accumule MNA exogène.
Ba études na biso in vitro e lakisi que MNA exogène e induire expression ya TNFα na ba cellules T mpe ematisaka liaison ya Sp1 na promoteur ya TNFα. Atako TNFα ezali na misala ya kobundisa tumeur mpe ya kobundisa tumeur, na cancer ya ovaires, TNFα ekoki kolendisa bokoli ya cancer ya ovaires ( 31-33 ). Neutralisation ya TNFα na culture ya ba cellules tumorales ya ovaire to élimination ya signal ya TNFα na ba modèles ya soso ekoki kobongisa production ya ba cytokines inflammatoires médiées par TNFα mpe kopekisa croissance ya tumeur ( 32 , 35 ). Na yango, na likambo oyo, MNA oyo euti na TME ekoki kosala lokola métabolite pro-inflammatoire na nzela ya mécanisme dépendant ya TNFα na nzela ya boucle autocrine, na yango kolendisa bozali mpe kopalangana ya cancer ya ovaires ( 31 ). Na kotalela likoki oyo, bokangami ya TNFα ezali koyekola lokola agent thérapeutique potentiel mpo na cancer ya ovaires ( 37 , 48 , 49 ). En plus, MNA ebebisaka cytotoxicité ya ba cellules CAR-T na ba cellules ya tumeur ya ovaires, epesaka ba preuves mosusu ya suppression immunitaire médiée par MNA. Na lisanga, ba résultats oyo epesi likanisi ya modèle oyo ba tumeurs na ba cellules CAF e sécréter MNA na TME extracellulaire. Na nzela ya (i) stimulation ya croissance ya cancer ya ovaire induite na TNF mpe (ii) inhibition ya activité cytotoxique ya ba cellules T induites na MNA, yango ekoki kozala na effet double tumeur (Figure 5D).
Mpo na kosukisa, na kosalelaka kosangisa ya enrichissement rapide ya ba cellules, séquençage ya cellule moko mpe profil métabolique, boyekoli oyo emonisaki bokeseni monene ya immunométabolomique kati na ba tumeurs mpe ba cellules ya ascite na ba malades ya HGSC. Analyse complète oyo elakisaki que bokeseni ezali na absorption ya glucose mpe activité mitochondriale entre ba cellules T, mpe e identifiaki MNA lokola métabolite régulateur immunitaire autonome non cellulaire. Ba données oyo ezali na impact na ndenge TME e affectaka métabolisme ya ba cellules T na ba cancers ya batu. Atako momekano ya semba mpo na biloko ya koleisa nzoto elobami kati na baselile T mpe baselile ya kanser, ba métabolites ekoki mpe kosala lokola ba régulateurs indirects mpo na kolendisa bokoli ya tumeur mpe mbala mosusu kopekisa biyano ya bokasi ya nzoto ya endogène. Bolimbisi mosusu ya rôle fonctionnel ya ba métabolites régulateurs oyo ekoki kofungola ba stratégies alternatives pona ko améliorer réponse immunitaire anti-tumoire.
Ba échantillons ya ba malades mpe ba données cliniques ezuami na nzela ya dépôt ya tissus ya tumeur ya cancer ya BC oyo e certifié na Réseau Canadian Tissue Repository Network. Engebene na protocole oyo endimami na Comité d’éthique ya bolukiluki ya cancer ya BC mpe na Iniversite ya Colombie-Britannique (H07-00463), ba échantillons nionso ya ba malades mpe ba données cliniques oyo ezwamaki na consentement informé na mokanda to elongolamaki officiellement consentement na bango. Ba échantillons ebombami na BioBank oyo ezali na certificat (BRC-00290). Bizalela ya sikisiki ya mobeli elakisami na ba tableaux S1 mpe S5. Mpo na kobatela yango na cryopreservation, basalelaka biscuit mpo na kopɔla na masini échantillon ya tumeur ya mobɛli mpe na nsima kotindika yango na filtre ya 100 microns mpo na kozwa suspension ya cellule moko. Ba centrifugé ascite ya maladi na 1500 rpm na boumeli ya miniti 10 na 4°C mpo na kosala ba pellets ya ba cellules mpe kolongola supernatant. Ba cellules oyo ezuami na tumeur na ascite e cryoconservée na sérum AB humain inactivé par chaleur 50% (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) na 10% ya sulfoxyde diméthyl. Ba suspensions wana ya cellule unique oyo ebatelamaki e décongelé mpe esalelamaki mpo na métabolomique mpe détermination ya ba métabolites oyo elimbolami awa na se.
Moyen complet ezali na RPMI 1640: AimV oyo ebakisami na 50:50 oyo e filtrer na 0,22 μm. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) oyo ebakisami na sérum AB humain inactivé na molunge ya 10% (Sigma-Aldrich), 12,5 mM ya Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x Solution ya pénicilline Streptomycine (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) mpe 50 μMB-mercaptoéthanol. AimV (Invitrogen) ebakisami na 20 mM ya Hepes (Thermo Fisher Scientific) mpe 2 mM ya l-glutamine (Thermo Fisher Scientific). Tampon ya coloration ya cytomètre ya flux ezalaki na saline tamponée na phosphate filtrée ya 0,22μm (PBS; Invitrogène) oyo ebakisami na sérum humain AB inactivé par chaleur 3% (Sigma). Tampon ya enrichissement cellulaire ezali composé ya PBS filtré ya 0,22μm mpe ebakisami na sérum AB humain inactivé par chaleur 0,5% (Sigma-Aldrich).
Na milieu complet ya 37°C, ba cellules e taché na 10 nM MT DR na 100 μM 2-NBDG na 30 minutes. Na nsima, batyaki baselile yango langi na langi ya viability eF506 na 4°C na boumeli ya miniti 15. Resuspendre ba cellules na FC Block (eBioscience) na Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), diluer na tampon ya coloration ya cytomètre d’écoulement (engebene na malako ya fabricant), mpe incuber na boumeli ya miniti 10 na température ambiante. Tache ba cellules na ensemble ya ba anticorps (tableau S2) na tampon ya coloration ya cytométrie ya flux na 4°C pendant 20 minutes. Resuspendre ba cellules na tampon ya coloration ya cytométrie ya flux (Cytek Aurora; configuration 3L-16V-14B-8R) avant analyse. Salelá SpectroFlo mpe FlowJo V10 mpo na kosala analize ya ba données ya nombre ya ba cellules, mpe salelá GraphPad Prism 8 mpo na kosala ba données. Intensité médiane ya fluorescence (MFI) ya 2-NBDG na MT DR e log-normalisé, mpe sima test t paire esalemaki pona analyse statistique pona ko comptabiliser ba malades oyo ekokani. Kolongola ba populations nionso oyo ezali na ba événements na se ya 40 na analyse ; kotia motuya ya MFI ya 1 pona ba valeurs nionso ya mabe yambo ya kosala analyse statistique pe visualisation ya ba données.
Pona ko compléter stratégie ya gating manuel ya panneau ya procédé oyo ezali likolo, tosalelaki annotation mobimba na nzete ya restriction ya forme (FAUST) (21) pona ko assigner automatiquement ba cellules na population après ko éliminer ba cellules mortes na FlowJo. To gérer manuellement sortie pona kosangisa ba populations oyo emonani lokola e misalloqués (kosangisa PD1+ na ba cellules PD1-tumor) na ba populations retenue. Échantillon moko na moko ezali na mwayene ya ba cellules koleka 2%, mpo na motango ya ba populations 11.
Centrifugation ya densité gradient ya ficoll esalemaki mpo na kokabola PBMC na biloko ya kokabola ba leucocytes (STEMCELL Technologies). Ba cellules T CD8 + elongolamaki na PBMC na nzela ya CD8 MicroBeads (Miltenyi) mpe epanzani na milieu complet na kosalelaka TransAct (Miltenyi) na boumeli ya poso 2 engebene na malako ya mosali. Ba cellules etikalaki kotelema mikolo 5 na milieu complet oyo ezalaki na IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), mpe sima e stimuler lisusu na TransAct. Na mokolo ya 7, engebene malako ya mosali, basalelaki ba MicroBeads CD45 ya moto (Miltenyi) mpo na ko enrichir ba cellules na ba tours misato oyo elandana. Ba cellules ekabolamaki na ba aliquotes mpo na analyse ya cytométrie ya flux (ndenge elobami likolo), mpe ba cellules milio moko e aliquoter mbala misato mpo na analyse LC-MS/MS. Ba échantillons esalemaki na nzela ya LC-MS/MS ndenge elobami awa na se. Tokanisaki motuya ya ba métabolites oyo ezangi na motango ya ba ions ya 1.000. Échantillon moko na moko e normalisé na nombre total ya ba ions (TIC), e convertir logarithmiquement pe e normaliser automatiquement na MetaboAnalystR avant analyse.
Suspension cellulaire unique ya malade moko na moko e décongelé mpe e filtrer na filtre ya 40 μm na milieu complet (ndenge elobami likolo). Engebene na protocole ya mosali, ba tour misato oyo elandi ya boponi ya malamu na nzela ya bokabwani ya biliki na nzela ya MicroBeads (Miltenyi) esalelamaki mpo na ko enrichir ba échantillons mpo na ba cellules CD8+, CD4+ mpe CD45- (na glace). Na mokuse, baselile ezongisamaka na kati ya tampon oyo ekómisaka baselile (ndenge tolobeli yango awa na likoló) mpe etángamaka. Ba cellules e incuber na ba perles ya CD8 ya moto, ba perles ya CD4 ya moto to ba perles ya CD45 ya moto (Miltenyi) na 4°C na boumeli ya 15 minutes, mpe sima esukolamaki na tampon d’enrichissement cellulaire. Eleki échantillon na colonne LS (Miltenyi), mpe ba fractions positifs na négatives esangisi. Mpo na kokitisa ntango mpe kosala ete etape ya kozongisa baselile ezala mingi, na nsima basalelaka fraction CD8 mpo na mbala ya mibale ya enrichissement ya CD4+, mpe fraction CD4 esalelamaka mpo na enrichissement ya CD45 oyo elandi. Bomba solution na glace na boumeli ya processus mobimba ya kokabola.
Mpo na kobongisa ba échantillons mpo na kosala analize ya ba métabolites, basukolaki baselile mbala moko na solution ya mungwa oyo ezali malili lokola glace, mpe babakisaki 1 ml ya méthanol 80% na échantillon mokomoko, na nsima basalaki yango vortex mpe ba congelé yango mbala moko na azote liquide. Ba échantillons esalemaki na ba cycles misato ya congelation-décongelation mpe e centrifugé na 14.000 rpm na boumeli ya miniti 15 na 4°C. Ba évaporer supernatant oyo ezali na ba métabolites tii ekokauka. Ba métabolites e fondu lisusu na 50 μl ya acide formique 0,03%, e vortex mpo esangisa, mpe sima e centrifugé mpo na kolongola ba débris.
Extraire ba métabolites ndenge elobami likolo. Botiaka supernatant na molangi ya chromatographie liquide ya performance ya likolo pona ba recherches ya métabolomique. Salelá protocole ya traitement aléatoire mpo na ko traité échantillon moko na moko na nombre ya ba cellules ya ndenge moko mpo na kopekisa ba effets ya lote. Tosalaki évaluation qualitative ya ba métabolites mondiaux oyo ebimisamaki liboso na AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). Analyse chromatographique pe intégration ya zone ya sommet esalemaki na nzela ya logiciel MultiQuant version 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Compte d’ions ya 1000 esalemaki pona ko estimation ya valeur ya métabolite oyo ezangi, pe TIC ya échantillon moko moko esalelamaki pona ko calculer etando ya sommet normalisé ya métabolite moko moko oyo ezuami pona ko corriger ba changements oyo ekotisama na analyse instrumentale à partir ya traitement ya échantillon. Sima ya normalisation ya TIC, MetaboAnalystR(51) (paramètre par défaut) esalelamaka pona conversion logarithmique pe échelle automatique ya ligne norme. Tosalelaki PCA na ensemble R vegan mpo na kosala analyse exploratoire ya ba différences ya métabolome entre ba types ya échantillon, mpe tosalelaki analyse ya redundance partielle mpo na ko analyser ba malades. Salelá méthode Ward pona kotonga dendrogramme ya carte chaleur pona ko cluster distance euclidienne entre ba échantillons. Tosalelaki limma (52) na ebele ya ba métabolites standardisées mpo na koyeba ba métabolites ebele ya ndenge na ndenge na kati ya type cellulaire mobimba mpe microenvironnement. Pona ko simplifier ndimbola, tosalelaka paramètre moyen ya groupe pona ko préciser modèle, pe totale ba types ya ba cellules na microenvironnement lokola groupe moko moko (n = 6 groupes); mpo na test ya signification, tosalaki ba mesures misato ya mbala na mbala mpo na métabolite moko na moko Pona ko éviter replication ya lokuta, malade akotisama lokola obstacle na design ya limma. Pona ko vérifier ba différences ya ba métabolites entre ba malades différents, to ajuster modèle ya limma y compris ba malades na ndenge ya fixe. Tozali koyebisa ntina ya bokeseni oyo emonisami liboso kati na lolenge ya baselile mpe microenvironnement ya Padj <0.05 (correction Benjamini-Hochberg).
Sima ya enrichissement ya vigour na nzela ya Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% viability), séquençage ya transcriptome ya cellule moko esalemaki na total ya ascites congelées vivantes mpe ba échantillons ya tumeur na nzela ya protocole ya expression ya 10x 5′gène. Ba cas mitano oyo ezalaki na ba tumeurs mpe ascites oyo ekokani e analysé, atako viability ya moke oyo ewutaki na échantillon moko ya tumeur epekisaki ko kotisa yango. Pona kozua ba sélections ebele ya ba malades, tosangisaki ba échantillons ya malade moko na moko na ba voies ya contrôleur ya chrome 10x, pe to analyser ba sites ya ascites na tumeur separatement. Nsima ya kosala molɔngɔ [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp nsuka ya mibale (PE), génome ya Québec; na moyenne ya 73.488 mpe 41.378 lectures par cellule mpo na tumeur mpe ascite respectivement]], tosalelaki CellSNP mpe Vireo (53) (based on CellSNP lokola The common human SNP (VCF) provided by GRCh38 is assigned a donor identity.Tosalelaka SNPRelate mpo na ko inferer identité ya penepene (IBS) ya état ya génotipe ya mobeli (IBS), excluant ba cellules non assignées mpe ba cellules identifiées comme duplexes mpe ba donateurs oyo ekokani entre ba échantillons ya ascite na tumeur (54) Na base ya mosala oyo, to gardaki ba cas misato na representation cellulaire ebele na tumeur na ascite pona analyse en aval Après kosala étape ya filtration ya masse na emballage ya scater (55) na scran (56), oyo epesaki 697 cellules (2792 and 4183 cells from tumor and ascites, respectively) for analysis. We use igraph's (57) Louvain clustering of shared nearest neighbor network (SNN) based on Jaccard distance to cluster cells by expression. The clusters were manually annotated to putative cell types based on marker gene expression and visualized with t-SNE. Cytotoxic T cells are elimbolami na expression ya CD8A na GZMA, kolongolaka ba sous-clusters oyo ezali na expression ya proteine ​​ribosomique ya nse To accéder na ba données publiées ya Izar et al (16), y compris intégration na bango ya t-SNE, ekoki ko contrôler superposition ya expression entre ba marqueurs ya ba cellules immunitaires.
PBMC ekabolamaki na biloko ya kokabola ba leucocytes (STEMCELL Technologies) na nzela ya centrifugation ya densité gradient ya Ficoll. Ba cellules CD3 + e isolé na PBMC na nzela ya ba perles CD3 (Miltenyi). Na présence to absence ya MNA, ba cellules CD3+ e activé na CD3 lié na plaque (5μg/ml), CD28 soluble (3μg/ml) na IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Na mokolo ya suka ya bopanzani, ba évaluer viabilité (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) pe prolifération (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) na cytométrie ya débit. Evaluer fonctionnement effecteur en stimulant ba cellules na PMA (20 ng/ml) na ionomycine (1μg/ml) na GolgiStop pendant 4 heures, pe ko suivre CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4) , BioLegend) na TNFα-fluorescéine isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD). Kolamusa ba cellules qPCR mpe ChIP na PMA (20 ng/ml) mpe ionomycine (1μg/ml) na boumeli ya ngonga 4. Bazwaki supernatant ya ELISA liboso mpe nsima ya stimulation na PMA (20 ng/ml) mpe ionomycine (1 μg/ml) na boumeli ya ngonga 4.
Landa protocole ya fabricant pona ko isoler ARN na nzela ya RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Salelá QIAshredder (QIAGEN) mpo na ko homogénéiser échantillon. Salelá trousse ya ARN na cADN ya capacité makasi (Thermo Fisher Scientific) mpo na kosala ADN complémentaire (ADNc). Salelá TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) mpo na ko quantifier expression ya ba gènes (engebene na protocole ya fabricant) na ba sondes oyo : Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glycéraldéhyde-3-phosphate libanda ya Hydrogène (GAPDH)] mpe Hs01010726_m1 (SLC22A2). Ba échantillons esalemaki na système ya PCR en temps réel StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) na plaque ya réaction optique rapide ya MicroAmp ya 96 puits (Applied Biosystems) na film optique ya MicroAmp. Valeur nionso ya Ct oyo eleki 35 etalelami lokola likolo ya seuil ya détection mpe etiamaki elembo lokola oyo ekoki komonana te.
Salá ChIP ndenge elobamaki liboso (58). Na mokuse, ba cellules esalemaki na formaldehyde (concentration finale 1,42%) mpe e incuber na température ambiante na boumeli ya 10 minutes. Salelá tampon ya kovimba oyo ebakisami (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl mpe 0,1% NP-40) na glace na boumeli ya miniti 10, na nsima zongisá yango na tampon ya immunoprécipitation ndenge elobami (58 ). Na nsima, ba soniqué échantillon na ba cycles oyo : 10 cycles (20 pulsations ya 1 seconde) mpe temps statique ya 40 secondes. Incuber ba anticorps ya grade ChIP immunoglobuline G (Technologie ya signalisation cellulaire; 1μl), histone H3 (Technologie ya signalisation cellulaire; 3μl), NFAT (Invitrogène; 3μl) mpe SP1 (Technologie ya signalisation cellulaire; 3μl) na échantillon na 4°CC koningana butu mobimba. Incuber ba perles ya proteine ​​A (Thermo Fisher Scientific) na échantillon na 4°C na koningana na malembe pendant 1 heure, sima salela ba perles chélex (Bio-Rad) pona ko enrichir ADN, pe salela proteinase K (Thermo Fisher) pona digestion ya proteine. Promoteur ya TNFα e détecté na PCR : liboso, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; au contraire, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (produit ya 207 bp). Ba images esalemaki na Image Lab (Bio-Rad) mpe e quantifiamaki na nzela ya logiciel ImageJ.
Bazwaki supernatant ya culture cellulaire ndenge elobami likolo. Détermination esalemaki selon ba procédures ya fabricant ya kit ya ELISA TNFα humain (Invitrogen), kit ya ELISA IL-2 humain (Invitrogen) mpe kit ELISA IFN-γ humain (Abcam). Engebene protocole ya mosali, ba dilué supernatant na 1:100 mpo na koyeba TNFα mpe IL-2, mpe 1:3 mpo na koyeba IFN-γ. Salelá EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) mpo na komeka absorbance na 450 nm.
PBMC ekabolamaki na biloko ya kokabola ba leucocytes (STEMCELL Technologies) na nzela ya centrifugation ya densité gradient ya Ficoll. Ba cellules CD3 + e isolé na PBMC na nzela ya ba perles CD3 (Miltenyi). Na présence to absence ya MNA, ba cellules CD3+ e activé na CD3 lié na plaque (5μg/ml), CD28 soluble (3μg/ml) na IL-2 (300 U/ml; Proleukin) pendant 3 jours. Nsima ya mikolo 3, basangisaki baselile mpe basukolaki yango na saline 0,9%, mpe batyaki pellet na congelé mbala moko. Compte ya ba cellules esalemaki na cytométrie ya flux (Cytek Aurora; configuration 3L-16V-14B-8R) na nzela ya 123count eBeads.
Extraire ba métabolites ndenge elobami likolo. Extrait oyo ekauki e reconstituer na concentration ya 4000 équivalents cellulaires/μl. Analyser échantillon na chromatographie en phase inversée (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) na colonne CORTECS T3 (2,1×150 mm, taille ya particule 1,6-μm, taille ya ba pores 120-Å; #186008500, Waters). Spectromètre de masse polaire (6470, Agilent), oyo ionisation ya électropulvérisation esalaka na mode positif. Phase mobile A ezali 0,1% ya acide formique (na H2O), phase mobile B ezali 90% ya acétonitrile, 0,1% ya acide formique. Gradient ya LC ezali 0 à 2 minutes pona 100% A, 2 à 7,1 minutes pona 99% B, pe 7,1 à 8 minutes pona 99% B. Na sima, rééquilibrer colonne na phase mobile A na débit ya 0,6 ml/min pendant 3 minutes. . Débit ezali 0,4ml/min, mpe chambre ya colonne e chauffer na 50°C. Salelá norme chimique ya peto ya MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) mpo na kosala temps ya retention (RT) mpe transformation (RT = 0,882 minutes, transformation 1 = 137→94,1, transformation 2 = 137→92 , Conversion 3 = 137→78). Tango ba transitions nionso misato esalemi na tango ya retention oyo esengeli, transition 1 esalelamaka pona quantification pona ko assurer spécificité. Courbe standard ya MNA (Toronto Research Chemical Company) esalemaki na ba dilutions sérieux motoba ya solution stock (1 mg/ml) mpo na kozua ba normes ya 0,1, 1,0, 10 mpe 100 ng/ml mpe 1,0 mpe 10μg/ml respectivement liquide. Limite ya détection ezali 1 ng/ml, mpe réponse linéaire ezali entre 10 ng/ml na 10μg/ml. Injection moko na moko ya microlitres mibale ya échantillon na standard esalelamaka pona analyse LC/MS, pe échantillon ya contrôle ya qualité mixte esalemaka chaque injections mwambe pona ko assurer stabilité ya plateforme ya analyse. Ba réponses ya MNA ya ba échantillons nionso ya ba cellules traitées na MNA ezalaki na kati ya intervalle linéaire ya test. Analyse ya ba données esalemaki na nzela ya logiciel ya analyse quantitative MassHunter (v9.0, Agilent).
Construct ya αFR-CAR ya deuxième génération ezuami na Song et al. (59) (59). Na mokuse, construction ezali na makambo oyo : séquence ya leader CD8a, fragment variable ya chaîne unique spécifique ya αFR ya moto, charnière mpe région transmembrane CD8a, domaine intracellulaire CD27 mpe domaine intracellulaire CD3z. Sequence ya CAR mobimba esalemaki na GenScript, mpe na sima e cloné na vecteur ya expression lentivirale ya deuxième génération en amont ya cassette ya expression ya GFP oyo esalelamaki pona ko évaluer efficacité ya transduction.
Lentivirus esalemaka na nzela ya transfection ya ba cellules HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); ekolisami na milieu Aigle modifié ya Dulbecco oyo ezali na 10% ya sérum bovin fœtal (FBS) mpe 1% ya PenStrep, mpe esalelami vecteur CAR-GFP mpe Ba plasmides ya emballage (psPAX2 mpe pMD2.G, Addgene) esalela amine ya lipofection (Sigma-Aldrich). Bazwaki supernatant oyo ezali na virus ngonga 48 mpe 72 nsima ya transfection, ba filtraki yango mpe ba concentré yango na nzela ya ultracentrifugation. Bomba supernatant virus concentré na -80°C kino transduction.
PBMC ekabwani na biloko ya kokabola ba leucocytes donateurs ya nzoto kolɔngɔnɔ (STEMCELL Technologies) na nzela ya centrifugation ya densité gradient ya Ficoll. Salelá ba microperles CD8 ya sélection positive (Miltenyi) mpo na ko isoler ba cellules CD8+ na PBMC. Kolamusa ba cellules T na TransAct (Miltenyi) mpe na milieu TexMACS [Miltenyi; ebakisami na 3% ya sérum ya moto oyo esalemi na molunge, 1% ya PenStrep mpe IL-2 (300 U/ml)]. Ngonga tuku mibale na minei sima ya stimulation, ba cellules T e transduire na lentivirus (10 μl ya supernatant ya virus concentré na 106 cellules). Mikolo 1 kino 3 sima ya transduction na Cytek Aurora (na FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), kotala expression ya GFP ya ba cellules mpo na kolakisa efficacité ya transduction ya au moins 30% .
Ba cellules CAR-T e cultivé pendant 24 heures na Immunocult (STEMCELL Technologies; ebakisami na 1% PenStrep) na ba conditions oyo : sans traitement, traité na 250 μM adénosine to 10 mM MNA. Sima ya prétraitement, ba cellules CAR-T esukolamaki na PBS mpe esangisamaki na ba cellules SK-OV-3 20.000 [ATCC; na milieu McCoy 5A (Sigma-Aldrich) oyo ebakisami na 10% ya FBS mpe 1% ya PenStrep na 10: Rapport effecteur na cible ya 1 e amplifié na triplicat na milieu Immunocult oyo ebakisami. Ba cellules SK-OV-3 na ba cellules SK-OV-3 lysées na digitalis saponine (0,5mg/ml; Sigma-Aldrich) esalemaki lokola ba contrôles négatifs na positifs, respectivement. Sima ya 24 heures ya co-cultivation, ba ramassaki supernatant pe ba mesurer lactate déshydrogénase (LDH) selon ba instructions ya fabricant (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Ba dilué supernatant ya LDH 1:50 na tampon LDH. Pourcentage ya koboma e mezamaki na nzela ya formule oyo : pourcentage ya koboma = pourcentage ya correction / taux maximum ya koboma x 100%, esika pourcentage ya correction = ba cellules co-culture-T kaka, mpe taux maximum ya koboma = contrôle positif-négatif.
Ndenge elobami na makomi to na biloko pe mayele, salela GraphPad Prism 8, Microsoft Excel to R v3.6.0 pona botangi ya statistique. Soki ba échantillons ebele ezuami na mobeli moko (lokola ascite na tumeur), tosalelaka test t paire to ko kotisa mobeli lokola effet aléatoire na modèle linéaire to généralisé ndenge esengeli. Pona analyse métabolomique, test ya importance esalemaka na triplicat.
Mpo na biloko ya kobakisa mpo na lisolo oyo, talá http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Oyo ezali article ya accès ouvert oyo ekabolami na ba conditions ya Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, oyo epesi nzela ya kosalela, kokabola pe ko reproduction na moyen nionso, soki kaka usage ya suka ezali pona gain commercial te pe premisse ezali que mosala ya ebandeli ezali correct. Referansi.
Liyebisi: Tosɛngi yo kaka opesa adresi na yo ya email mpo moto oyo opesi toli na lokasa ayeba ete olingi amona email yango mpe ezali spam te. Tokokanga ata adresse email moko te.
Motuna oyo esalelamaka mpo na komeka soki ozali mopaya mpe kopekisa kotinda ba spam automatique.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T., oyo azali na bomoi na ntango ya kala.
MNA esalisaka mpo na kopekisa bokasi ya nzoto ya baselile T mpe ezali komonisa eloko oyo ekoki kozala cible ya immunothérapie mpo na kosalisa kanser ya moto.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T., oyo azali na bomoi na ntango ya kala.
MNA esalisaka mpo na kopekisa bokasi ya nzoto ya baselile T mpe ezali komonisa eloko oyo ekoki kozala cible ya immunothérapie mpo na kosalisa kanser ya moto.
©2021 Lisangá ya Amerika mpo na botomboli siansi. makoki nyonso mazali ya yo. AAAS ezali partenaire ya HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef mpe COUNTER. Bokoli ya siansi ISSN 2375-2548.