Kosala triage ya proteine ​​na nzela ya sécrétion ezali na ntina mingi mpo na kobatela compartimentation cellulaire mpe homéostase. Longola triage médié par coquille, rôle ya ba lipide na triage ya kinesine na processus ya transport sécrétoire ezali question ya base oyo ewumeli kala oyo ezui eyano te. Awa, tosalaka 3D simultané multicolor haute résolution imagerie en temps réel mpo na ko prouver in vivo que ba protéines immobilisées na glycosylphosphatidylinositol ya sika synthétisées na ba fragments ya lipide céramide très longues ezali clustered mpe classifiées na ba endoplasmes spécialisés Site de sortie net, oyo ekeseni na oyo esalelamaka na ba protéines transmembranes. En plus, tozali kolakisa que longueur ya chaîne ya céramide na membrane ya réticulum endoplasmique ezali critique pona sélectivité oyo ya triage. Boyekoli na biso epesi ba preuves directes ya liboso in vivo pona ko classer ba cargos ya proteine ​​sur la base ya longueur ya chaîne lipide na ba sites sélectifs ya exportation na voie sécrétoire.
Na baselile eucaryote, na nsima, baproteini oyo esalemi na réticulum endoplasmique (ER) ekabolamaka na ntango ya komema yango na nzela ya sécrétion mpo ekóma na esika oyo ebongi na baselile (1). Longola triage médié par manteau, ekanisamaki banda kala ete ba lipide mosusu ekoki mpe kozala lokola ba points de sortie sélectifs en clustering yango na ba domaines spécifiques ya membrane oyo ba protéines spécifiques (2-5). Kasi, ezali naino na bozangi ya bilembeteli ya semba in vivo mpo na kolakisa ete mwango yango ekoki kozala na nzela ya lipide. Pona ko résoudre problème oyo ya base, to yekolaki na levure ndenge nini ba protéines ancrées ya glycosylphosphatidylinositol (GPI) (GPI-APs) e exporter différentiellement depuis ER. Ba GPI-AP ezali baproteini ndenge na ndenge ya likoló ya baselile oyo ekangami na lipide ( 6, 7 ). GPI-AP ezali proteine ​​oyo ebimaka mpe ekangami na ba feuilles ya libanda ya membrane ya plasma na nzela ya fraction glycolipide (ancre GPI). Bandimaka ba ancres ya GPI lokola ba modifications post-traductionnelles conservatrices na lumen ya ER (8). Nsima ya kokangama, GPI-AP elekaka na aparɛyi ya Golgi (5, 9) longwa na ER tii na membrane ya plasma. Kozala ya ba ancres ya GPI esalaka que GPI-AP e transporter separatement na ba protéines sécrétées transmembrane (y compris ba protéines misusu ya membrane plasmatique) na nzela ya sécrétion ( 5 , 9 , 10 ). Na baselile ya levure, ba GPI-AP ekabolamaka na baproteini mosusu oyo ebimaka na kati ya réticulum endoplasmique, mpe na nsima ekangamaka na kati ya ba vésicule oyo ekeseni na mosusu oyo ezingami na complexe ya proteine ​​ya manteau II (COPII) ( 6 , 7 ). Ba déterminants ya processus ya classification oyo na processus ya exportation ya ER ezali clair te, kasi e spéculé que mécanisme oyo ekoki kosenga ba lipide, surtout remodelage structurel ya eteni ya lipide ya ancre ya GPI ( 5 , 8 ). Na levure, remodelage ya lipide ya GPI ebandaka mbala moko sima ya kokangama ya GPI, mpe na makambo mingi, esalaka que céramide ekangama na acide gras saturé à chaîne longue 26 carbones (C26:0) (11, 12). C26 céramide ezali céramide ya monene oyo esalemi na ba cellules ya levure tii sikoyo. Esalamaka na ER mpe mingi na yango etindamaka na aparɛyi ya Golgi na nzela ya ba vésicule COPII (13). Exportation ya ER ya GPI-AP esengaka spécifiquement synthèse ya céramide oyo ezali ko continuer ( 14 , 15 ), mpe na ngambo na yango, conversion ya céramide na céramide ya phosphate inositol (IPC) na appareil Golgi etali synthèse ya ancre ya GPI ( 16 ). Ba études biophysiques na ba membranes artificielles e lakisi que ba céramides ya chaîne acylique ya milayi mingi ekoki ko coalesser pona kosala ba domaines ordonné na ba propriétés physiques unique ( 17 , 18 ). Ba données oyo ememaka na hypothèse que céramide C26 na GPI-AP na céramide C26 basalelaka ba propriétés physiques na bango pona ko coalesser na ba régions to ba régions ordre na environnement lipide ya membrane ER relativement désordonnée. Ezali mingimingi na ba glycérolipides ya mikuse mpe ya insaturés (C16:1 mpe C18:1) (19, 20). Ba régions oyo ekozala sélectivement concentrées na ba sites spécifiques ya sortie ya ER (ERES), esika GPI-AP à base ya céramide na céramide ekoki kozala co-transporté na Golgi na même vésicules dédié ya COPII (5).
Na boyekoli oyo, tomekaki directement mécanisme oyo basé na lipide na kosalelaka microscopie ya imagerie confocale super-résolution en temps réel (SCLIM), oyo ezali technique ya microscopie ya sika oyo ekoki ko observer en même temps ba protéines marquées na fluorescent Ba images ya couleur misato na trois dimensions (3D) ezali na résolution mpe vitesse ya likolo mingi na ba cellules vivantes (21, 22).
Tosalelaki liboso technologie SCLIM mpo na kolimbola lisusu ndenge nini GPI-AP normal na groupe céramide C26 e dépissé na ba protéines sécrétées transmembrane sima ya kolongwa na ER na S. cerevisiae. Pona ko vérifier classification ya ER, tosalelaki système génétique oyo ekoki directement ko visualiser cargo ya sika synthétisé oyo ekoti na ERES in vivo ( 7 , 23 ). Lokola cargo, toponaki C26 céramide-based GPI-AP Gas1 marqué na proteine ​​fluorescente vert (GFP) mpe transmembrane sécrété proteine ​​Mid2 marqué na proteine ​​fluorescent proche infrarouge (iRFP), oyo nyonso mibale cible membrane plasmatique ( 24–26 ). Na mutant sec31-1 oyo ezali sensibles na température, ba cargos mibale oyo e exprimer na se ya promoteur inducible na galactose mpe na marqueur ERES constitutif. Na température extrême (37°C), lokola mutation sec31-1 e affectaka fonctionnement ya composante ya couche ya COPII Sec31 pona ko inhiber germination ya COPII na exportation ya ER, cargo ya sika synthétisé e accumule na ER (23). Nsima ya kosala malili tii na molunge ya nse (24°C), baselile oyo ebongwani na sec31-1 ezongaki na esika oyo ebimisaki biloko, mpe babandaki kotinda biloko ya sika oyo esalemaki na ER. Visualisation ya CLIM elakisaki que mingi ya ba Gas1-GFP na Mid2-iRFP oyo esalemi sika e accumule encore na ER ya ba cellules mutant sec31-1 sima ya incubation na 37°C et puis ebimisamaki na 24°C pendant 5 minutes (Figure 1). Lokola Mid2-iRFP ekabolami na membrane ER mobimba, mpe Gas1-GFP e concentré mpe esangisi na esika ya membrane ER discontinue, distribution na yango ekeseni mpenza (Figure 1, A à C mpe Film S1). En plus, ndenge elakisami na figure 1D, cluster ya Gas1-GFP ezali na Mid2-iRFP te. Ba résultats oyo ezo lakisa que ba protéines ya GPI-AP na transmembrane ekabolamaki na ba régions ya membrane ER différentes na ebandeli. Cluster ya Gas1-GFP ezali pembeni ya ERES spécifique oyo e marqué na proteine ​​ya couche COPII ya mCherry Sec13 (Figure 1, E na F, na film S1) (23).
ba cellules sec31-1 e exprimaka ba sécrétions induites par galactose, chaîne acylique ya molayi (C26) céramide GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, vert) na proteine ​​transmembrane Mid2-iRFP (TMP, bleu) mpe oyo Constructive ERES marquage Sec13-mCherry (ERES, magenta) e incuber na 37°C pendant 30 minutes, e déplacer na 24°C, mpe ezwami na bililingi na SCLIM miniti 5 na nsima. (A kino C) ezali kolakisa elilingi ya 2D oyo esangisami to oyo ezali komonisama ya plan (A), elilingi ya projection 2D ya biteni z 10 (B) to elilingi ya hémisphère cellulaire 3D ya ba marqueurs ya cargo mpe ya ERES (C). Barre ya échelle 1μm (A na B). Unité ya échelle ezali 0,551μm (C). Gas1-GFP ezwamaki na ba régions to ba clusters ya ER discrètes, nzokande Mid2-iRFP ezwamaki mpe ekabolamaki na membrane mobimba ya ER (C). (D) Graphique ezali kolakisa intensité relative ya fluorescence ya Gas1-GFP na Mid2-iRFP na cluster ya Gas1-GFP na ligne ya flèche ya pembe (na gauche). AU, unité arbitraire. (E mpe F) ezali komonisa elilingi ya 3D oyo esangisaka biloko mpe elembo ya ERES. Ba clusters ya Gas1-GFP ezuami pene ya ERES spécifique. Unité ya échelle ezali 0,551μm. (F) Fléche solide ya pembe ezali ko marquer cluster ya Gas1-GFP oyo ezo sangana na ERES. Ba panneaux ya kati pe ya droite ezali kolakisa image 3D oyo ebakisami oyo ebakisami pe vue rotative ya cluster Gas1-GFP oyo eponami.
Relation spatiale ya proche entre cluster Gas1-GFP na ERES spécifique elakisi que Gas1-GFP ekoki kokota na ERES sélectif, oyo ekeseni na sélectivité oyo Mid2-iRFP esalela pona kobima na ER. Pona ko régler possibilité oyo, to quantifiaki rapport ERES pona kaka biloko moko to mibale (Figure 2, A à C). Tomoni ete mingi ya ERES (70%) ezali kaka na lolenge moko ya biloko. Elilingi ya se ya figure 2C ezali kolakisa bandakisa mibale ya momesano ya ERES na kaka Gas1-GFP (Figure 1) to kaka Mid2-iRFP (Figure 2). Na bokeseni, pene na 20% ya ERES ezali na ba cargos mibale oyo ezo superposer na esika moko. Emonanaki ete ba ERES mosusu (10%) ezalaki na lolenge mibale ya biloko, kasi ekabolamaki na bisika bikeseni polele. Na yango, botangi ya statistique oyo elakisi ete sima ya bobimisi ER na mboka mopaya, GPI-AP Gas1-GFP na cargo transmembrane Mid2-iRFP ekabolami na ERES ekeseni (Figure 2D). Efficacité oyo ya triage ekokani mingi na analyse biochimique oyo esalemaki liboso (6) mpe na détermination morphologique (7). Tokoki pe kotala comportement ya ba cargos quarantinés oyo ekoti na ERES (Figure 2E pe Film S2). Figure 2E ezali kolakisa ete kaka eteni moke ya Gas1-GFP (panneau 3) to Mid2-iRFP (panneau 4) ekoti na ERES uta ngambo moko pe ekangami na esika ya discret. Panneau 5 ya figure 2E ezali kolakisa que Gas1-GFP na Mid2-iRFP ezwamaka tango mosusu na ERES moko, kasi ekoti na ngambo ekeseni mpe e concentré na ba régions ekeseni oyo ekoki ko représenter ba vésicule COPII différentes. To confirmaki mpe que séparation observée mpe classification ya GPI-AP Gas1 basé na céramide C26 lokola ERES sélectif ezali spécifique mpo cargo mosusu ya sécrétion transmembrane, proteine ​​ya membrane plasmatique marquée na GFP Axl2 (27 ), oyo ezali kolakisa comportement ya ndenge moko na Mid2-iRFP. (Elilingi S1 mpe Filme S3). Axl2-GFP oyo esalemi sika ekabolami na nzela ya membrane ya ER lokola Mid2-iRFP (Figure S1, A mpe B), mpe ezali co-localisé na Mid2-iRFP na mingi ya ERES (Figure S1, B kino D). Ba panneaux 1 pe 2 ya figure 1. S1C elakisi ba exemples mibale ya typique ya ERES esika ba cargos transmembranes mibale ezo superposer. Na makambo oyo, biloko nyonso mibale ekotaka na ERES esika moko (Figure S1E, Panneau 3 na Film S3).
Ba cellules sec31-1 oyo e exprimaka ba sécrétions inducibles na galactose, Gas1-GFP (GPI-AP, vert) na Mid2-iRFP (TMP, bleu) na marquage ERES constitutif Sec13-mCherry (ERES, magenta) etiemaki na 37 Sima ya ko incuber pendant 30 minutes na °C, ekende na 24 °C pona kobimisa bloc ya sécrétion, pe image na SCLIM sima Miniti 20. (A kino C) Bilili ya projection 2D oyo ezali komonisa (A; barre d’échelle, 1μm) to bilili ya hémisphère cellulaire 3D (B mpe C; unité d’échelle, 0,456μm) ya cargo mpe biteni ya z 10 oyo etiamaki elembo na ERES. Panneau ya se na (B) mpe panneau na (C) elakisaka bilili oyo esalemi mpo na kolakisa kaka biloko oyo ezali na ERES (magenta) [Gas1-GFP (gris) mpe Mid2-iRFP (bleu clair)]. (C) Fléche ya polele : ERES ememaka kaka eteni moko ya biloko (1 kino 4). Fléche gris: ERES ezali na biloko oyo ekabwani (5). Fléche solide blanc: ERES oyo ezali na cargo co-local. Na nse: ERES moko oyo eponami ezali kaka na Gas1-GFP (1) to Mid2-iRFP (2). Barre ya échelle, 100 nm. (D) Botangi ya motango ya fotomicrographie oyo elimbolami na (C). Moyenne ya pourcentage ya ERES oyo ezali kaka na cargo moko (Gas1-GFP to Mid2-iRFP), cargo séparé pe cargo oyo ezo superposer. Na ba expériences misato indépendantes, n=432 na ba cellules 54. Barre ya erreur = SD. Test ya t unpaired ya mikila mibale. *** P = 0,0002. Ezali na ntina mingi. (E) Elilingi 3D ya ERES oyo eponami ya biloko oyo etiamaki na quarantaine oyo etiamaki elembo na (C). Gas1-GFP (vert) (3) to Mid2-iRFP (bleu) (4) ekoti na ERES (magenta) uta ngambo moko mpe ekangami na esika moke na kati ya ERES. Tango mosusu, lolenge nyonso mibale ya biloko ekɔtaka na ERES moko (5) uta na ngambo moko mpe ekangami na esika moko oyo ezali mosika na kati ya ERES. Barre ya échelle, 100 nm.
Na sima, tomekaki hypothèse oyo elobi que céramide ya chaîne acylique ya molayi (C26) oyo ezali na membrane ya ER e diriger clustering spécifique mpe triage ya Gas1 na ERES sélectif. Mpo na yango, tosalelaki souche ya levure modifiée GhLag1, oyo kati na yango ba synthases mibale ya céramide endogène Lag1 mpe Lac1 e remplacé na GhLag1 (homologue Lag1 ya coton), oyo esali que souche ya levure ezala na membrane cellulaire souche Ceramide mokuse koleka type sauvage (Figure 3A) (28). Analyse ya spectrométrie de masse (MS) elakisaki ete na ba souches ya type sauvage, 95% ya céramide mobimba ezali céramide ya chaîne ya molayi mingi (C26), nzoka nde na GhLag1, 85% ya céramide ezali molai mingi (C18 na C16). ), kaka 2% ya céramide nde ezali céramide ya monyololo molai mingi (C26). Atako ba céramides C18 mpe C16 ezali ba céramides ya minene oyo ezwami na membrane ya GhLag1 kino sikoyo, analyse MS endimisi mpe ete ancre GPI ya Gas1-GFP oyo emonisami na souche GhLag1 ezali na céramide C26, oyo ekokani na ba lipide ya lolenge ya zamba. Bolamu ezali ndenge moko (Fig. 3A) (26). Na yango, yango elakisi ete enzyme ya remodelage ya céramide Cwh43 ezali très sélective mpo na céramide C26, ndenge elakisami na figure 26, esangisi na ndenge ya malamu ancre ya GPI oyo euti na mwa ndambo ya céramide C26 na souche GhLag1. S2 (29) (29) mpe. Atako bongo, membrane cellulaire ya GhLag1 ezali na ntina mingi kaka na céramide C18-C16, nzokande Gas1-GFP ezali naino na céramide C26. Le fait oyo ekomisaka souche oyo outil idéal pona ko résoudre spécifiquement problème ya longueur ya chaîne acyle ya céramide ya membrane na ER. Role hypothétique ya classe na triage. Na sima, toyekolaki liboso makoki ya C26 Gas1-GFP ya ko accumule na ba clusters na GhLag1 na allele mutant sensible na température ya sec31-1 na nzela ya microscopie ya fluorescence conventionnelle, esika kaka chaîne ya molayi (C18-C16) nde ezali na membrane ER Ceramide (Fig. 3). Tomoni ete na sec31-1, mingi ya Gas1-GFP ezalaki concentré na ba clusters, alors que Gas1-GFP na sec31-1 GhLag1 na membrane ER ya céramide ya molayi (C18-C16) ya molayi ezalaki mingi mingi te clustered mpe ekabolamaki na Na membrane ER mobimba. Mpo na kozala na bosikisiki, lokola clustering basé na céramide C26 ezali na boyokani makasi na ERES spécifique (Figure 1), na sima to investigaki soki procédé oyo ekoki pe kozala na fonctionnement ya mécanisme ya proteine ​​ya exportation ya ER. GPI-AP esalela système spécial COPII mpo na exportation ya ER, oyo ezali régulé activement na remodelage structurel ya Ted1 ya eteni ya glycan ya ancre ya GPI ( 30 , 31 ). Na sima, GPI-glycan recombinante eyebani na complexe p24 ya récepteur ya cargo transmembrane, oyo na ngambo na yango e recruter sélectivement Lst1, oyo ezali isoforme spécifique ya sous-unité ya liaison cargo COPII ya munene Sec24, kosala COPII riche na GPI-AP Ba vésicule ezali nécessaire (31-33). Na yango, totongaki double mutant oyo esangisaki deletion ya ba protéines oyo ya se moko (composante complexe p24 Emp24, enzyme remodelage GPI-glycan Ted1 mpe sous-unité spécifique COPII Lst1) na souche mutant sec31-1, mpe toyekolaki yango Est-ce que ezali possible ya kosala GFP ya cluster ya Gas1 (Figure 3). Tomoni ete na sec31-1emp24Δ mpe sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP ezali mingimingi kozanga bituluku mpe ekabolami na membrane mobimba ya ER, lokola emonanaki liboso na sec31-1 GhLag1, nzokande na sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP Lokola sec31-1. Ba résultats oyo ezo lakisa que en plus ya présence ya céramide C26 na membrane ER, clustering ya Gas1-GFP esengeli pe ekangama na complexe p24, pe esengaka recrutement spécifique ya Lst1 te. Na sima, totalaki possibilité que longueur ya chaîne ya céramide na membrane ER ekoki ko réguler liaison ya Gas1-GFP na p24. Kasi, tomonaki ete bozali ya céramide C18-C16 na membrane ezali na bopusi te na ba GPI-glycans oyo etongami lisusu na complexe p24 (Figures S3 mpe S4, A mpe B) to kokangama na GPI-AP mpe ko exporter GPI-AP. makoki. Ko recruter sous-type ya COPII Lst1 (Figure S4C). Na yango, clustering dépendant ya céramide C26 esengaka te ba interactions ya proteine ​​na ba mécanismes différents ya proteine ​​ya exportation ya ER, kasi e soutenir mécanisme alternatif ya triage oyo etambwisami na longueur ya lipide. Na sima, to analyser soki longueur ya chaîne acyle ya céramide na membrane ER ezali important pona classification efficace ya Gas1-GFP comme ERES sélectif. Lokola Gas1 na souche GhLag1 na céramide ya monyololo mokuse ebimaka na ER mpe ekoti na membrane plasmatique (Figure S5), tondimi ete soki triage etambwisami na bolai ya monyololo ya acyle ya céramide, Gas1 na souche GhLag1 ekoki ko redirectionner mpe kokatisa. Biloko ya ERES na membrane moko.
(A) Membrane cellulaire ya GhLag1 ezali mingimingi na ba céramides C18-C16 ya mikuse, nzokande ancre GPI ya Gas1-GFP ezali naino na C26 IPC ndenge moko na ba cellules ya type sauvage. Likolo : analyse ya longueur ya chaîne acylique ya céramide na membrane cellulaire ya ba souches ya type sauvage (Wt) na GhLag1p na spectrométrie de masse (MS). Ba données ezali komonisa pourcentage ya céramide totale. Mwayene ya ba expériences misato indépendantes. Barre ya erreur = SD. Test ya t unpaired ya mikila mibale. **** P 0.0001. Ezali na ntina mingi. Panneau ya se : Analyse MS ya longueur ya chaîne acylique ya IPC oyo ezali na ancre GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) oyo e exprimer na ba souches ya type sauvage na GhLag1p. Ba données ezali ko représenter pourcentage ya signal IPC total. Mwayene ya ba expériences mitano indépendantes. Barre ya erreur = SD. Test ya t unpaired ya mikila mibale. ns, ezali na ntina te. P = 0,9134. Ezali na ntina te. (B) Fluorescence micrographs of sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ and sec31-1lst1Δ cells expressing galactose-induced Gas1-GFP were incubated at 37°C for 30 minutes and passed down to Perform routine fluorescence microscopy after 24°C. Fléche ya pembe: Cluster ya ER Gas1-GFP. Fléche ouverte: Gas1-GFP non clustered ekabolami na membrane mobimba ya ER, ezali kolakisa coloration ya bague nucléaire oyo ezali caractéristique ya ER. Barre ya échelle, 5μm. (C) Botangi ya motango ya fotomicrographie oyo elimbolami na (B). Mwayene ya ba cellules oyo ezali na structure ya Gas1-GFP ya punctate. Na ba expériences misato indépendantes, n≥300 cellules. Barre ya erreur = SD. Test ya t unpaired ya mikila mibale. **** P 0.0001. Ezali na ntina mingi.
Pona ko résoudre directement problème oyo, tosalaki visualisation SCLIM ya Gas1-GFP na Mid2-iRFP na GhLag1 na allele mutant sec31-1 sensitive na température (Figure 4 et Film S4). Sima ya kobatela ER na 37°C mpe na sima kobimisama na 24°C, mingi ya Gas1-GFP oyo esalemaki sika esanganaki te mpe ekabolamaki na membrane mobimba ya ER, ndenge emonanaki na ba microscopes ya momesano (Figure 4, A mpe B ). Lisusu, motango monene ya ERES (67%) ezali na lolenge mibale ya biloko oyo ezali na esika moko na kati na yango (Figure 4D). Ba panneaux 1 pe 2 ya figure 4C ezali kolakisa bandakisa mibale ya momesano ya ERES na Gas1-GFP pe Mid2-GFP oyo ezo superposer. En plus, biloko nionso mibale ezuami na ERES moko (Figure 4E, panneau 3 na film S4). Na yango, ba résultats na biso ezo lakisa que longueur ya chaîne acyle ya céramide na membrane ya ER ezali déterminant important ya agrégation na classification ya proteine ​​ya ER.
Ba cellules ya Sec31-1 GhLag1 oyo e exprimaka ba sécrétions induites par galactose, Gas1-GFP (GPI-AP, vert) na Mid2-iRFP (TMP, bleu) na Sec13-mCherry (ERES, magenta) marqué na ERES constitutif Ba incuber na 37°C. Koba na boumeli ya miniti 30, kokita na 24°C mpo na kobimisa ba sécrétions, mpe kosala image na SCLIM nsima ya miniti 20. (A kino C) Bilili ya projection 2D oyo ezali komonisa (A; barre d’échelle, 1μm) to bilili ya hémisphère cellulaire 3D (B mpe C; unité d’échelle, 0,45μm) ya ba 10 z-sections oyo etiamaki elembo na cargo mpe ERES. Panneau ya se na (B) mpe panneau na (C) elakisaka bilili oyo esalemi mpo na kolakisa kaka biloko oyo ezali na ERES (magenta) [Gas1-GFP (gris) mpe Mid2-iRFP (bleu clair)]. (C) Fléche oyo etondi na pembe: ERES, biloko ezo superposer. Fléche ya polele: ERES ezali kaka na eloko moko. Panneau inférieur : ERES oyo eponami ezali na biloko oyo ezo superposer (1 na 2) oyo e marqué na (C). Barre ya échelle, 100 nm. (D) Botangi ya motango ya fotomicrographie oyo elimbolami na (C). Na ba unité sec31-1 pe sec31-1 GhLag1, kaka cargo moko (Gas1-GFP to Mid2-iRFP) nde ekotisami, pe moyenne ya pourcentage ya ERES pona cargo isolé pe cargo oyo ezo superposer. Na ba expériences misato indépendantes, n = 432 na ba cellules 54 (sec31-1) mpe n = 430 na ba cellules 47 (sec31-1 GhLag1). Barre ya erreur = SD. Test ya t unpaired ya mikila mibale. *** P = 0,0002 (sec31-1) mpe ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Elilingi 3D ya ERES oyo eponami na biloko oyo bizali kozipa (3) oyo etiamaki elembo na (C). Gas1-GFP (vert) na Mid2-iRFP (bleu) epusani na ERES (magenta) na ngambo moko pe etikalaka na esika moko oyo ERES epekisami. Barre ya échelle, 100 nm.
Boyekoli oyo epesi ba preuves directes in vivo que ba cargos ya proteine ​​basé na lipide e classifié na ba sites sélectifs ya exportation na voie sécrétoire, mpe emonisaka importance ya longueur ya chaîne acyle pona sélectivité ya classification. Na kosaleláká mayele ya microscopie ya nguya mpe ya sika oyo babengi SCLIM, tomonisaki Gas1-GFP oyo esalemi sika (eteni monene ya membrane plasmatique GPI-AP oyo ezali na monyololo ya molai mpenza ya acyle (C26) ya lipide ya céramide) na levure ) Ba régions oyo esangisi na ba ERs discrètes ezali na boyokani na ERES spécifique, nzokande ba proteines oyo ebimisami na transmembrane ekabolami na membrane mobimba ya ER (Elilingi 1). En plus, ba types mibale oyo ya biloko ekoti na ERES différents sélectivement (Figure 2). Bolai ya monyololo acylique ya céramide cellulaire na membrane ekitisami uta C26 kino C18-C16, cluster ya Gas1-GFP ebebisami na etuka ya ER discrète, mpe Gas1-GFP ebongwani mpo na kolongwa na ER na proteine ​​transmembrane na nzela ya ERES moko (Figure 3 mpe Figure 3). 4).
Atako GPI-AP esalelaka mécanisme ya proteine ​​spécialisé mpo na kobima na ER, tomonaki ete separation dépendante ya céramide ya C26 etie motema te na ba interactions différentielles ya proteine ​​oyo ekoki komema na spécialisation ya ERES (Figures S4 et S5). Na esika na yango, makambo oyo tomoni ezali kosunga mécanisme mosusu ya classification oyo etambwisami na clustering ya proteine ​​basé na lipide mpe na sima exclusion ya ba cargos mosusu. Ba observations na biso ezo lakisa que région to cluster ya Gas1-GFP oyo ezo sangana na ERES spécifique ezangi proteine ​​sécrétée transmembrane Mid2-iRFP, oyo ezo lakisa que cluster ya GPI-AP dépendant ya céramide C26 eko faciliter entrée na bango na ERES pertinent, et en même temps, exclure transmembrane Ba sécrétions ekoti na ERES oyo en particulier (Figures 1 et 2). Na bokeseni, bozali ya ba céramides C18-C16 na membrane ya ER esalaka te ete GPI-AP esala ba régions to ba clusters, yango wana elongolaka te to ezongisaka te ba protéines oyo ebimisami na transmembrane na ERES moko (Figures 3 et 4). . Na yango, tozali ko proposer que céramide C26 ezo diriger séparation na classification en facilitant clustering ya ba protéines liées na ERES spécifique.
Ndenge nini kozua clustering oyo dépendant ya céramide C26 na esika ya ER spécifique? Tendance ya céramide ya membrane ya kokabwana na ngambo ekoki kosala ete GPI-AP mpe céramide C26 esala ba lipide ya mike mpe oyo ezali na ordre instantanément na environnement ya lipide oyo ezali irreguliers mingi ya membrane ER oyo ezali na ba glycérolipides ya mikuse mpe ya insaturés. Ba clusters ya qualité (17, 18). Ba clusters wana ya mike ya temporaire ekoki ko fusionner lisusu na ba clusters ya minene, stable sima ya kokangama na complexe p24 ( 34 ). Na boyokani na yango, tolakisaki ete C26 Gas1-GFP esengeli kosala interaction na complexe p24 mpo na kosala ba clusters ya minene oyo emonanaka (Figure 3). Complexe p24 ezali oligomère hétérozygote oyo esalemi na ba protéines transmembranes p24 minei ekeseni na levure ( 35 ), oyo epesaka bokangami ya multivalent, oyo ekoki komema na réticulation ya ba clusters ya mike ya GPI-AP, na yango kobimisa cluster Stable ya monene ( 34 ). Interaction entre ba ectodomaines proteines ya ba GPI-APs ekoki pe ko contribuer na agrégation na bango, ndenge elakisami na tango ya transport na bango ya Golgi na ba cellules épithéliales polarisées ya ba mamans ( 36 ). Kasi, ntango céramide C18-C16 ezali na kati ya membrane ya ER, ntango complexe p24 ekangami na Gas1-GFP, bituluku minene oyo ekabwani ekosalema te. Mecanisme ya sous-jacente ekoki ko dépendre na ba propriétés spécifiques physiques mpe chimiques ya céramide ya chaîne acyle ya molayi. Ba études biophysiques ya ba membranes artificielles ezo lakisa que atako ba céramides ya chaîne acylique ya milayi (C24) pe ya mokuse (C18-C16) ekoki kosala séparation ya phase, kaka ba céramides ya chaîne acylique ya milayi (C24) nde ekoki ko promouvoir Courbure ya likolo pe kogumbama ya film pona ko reshaper film. Na nzela ya boyokani (17, 37, 38). Emonani ete hélice transmembrane ya TMED2, homologue humain ya Emp24, e interagir sélectivement na sphingomyéline à base ya céramide C18 na ba lobules cytoplasmiques ( 39 ). Na kosalelaka ba simulation ya dynamique moléculaire (MD), tomonaki ete ba céramides C18 mpe C26 e accumule zinga zinga ya ba lobules cytoplasmiques ya hélice transmembrane Emp24, mpe bazali na ba préférences ya ndenge moko (Figure S6). Ezali na ntina koyeba ete yango ezali kolakisa ete hélice transmembrane ya Emp24 ekoki komema na distribution asymétrique ya ba lipide na membrane. Oyo ezali mbano oyo euti kosalema kala mingi te oyo euti na baselile ya banyama oyo ememaka mabɛlɛ. Ba simulation ya MD ya ndenge moko elakisaka pe présence ya ba lipide éther (40) . Yango wana, tozali kokanisa ete céramide ya C26 oyo ezali na ba lobules mibale ya ER26 ezali enrichie localement. Tango GPI-AP na ba lobules luminal ekangami directement na p24 multivalent mpe accumulation ya céramide C26 autour ya p24 na ba lobules cytoplasmiques, ekoki ko promouvoir agrégation ya Protéine oyo ezo accompagner mpe courbure ya membrane esalemaka na nzela ya misapi ( 41 ), kosala que GPI-AP ekabwana na ba régions discrètes pembeni ya ERES, oyo pe e favorisaka ba courbures makasi bitúká ya membrane ya ER (42). Ba rapports ya kala esungaki mécanisme oyo esengami (43, 44). Bokangami ya ba oligolectines, ba pathogènes to ba anticorps multivalent na ba glycosphingolipides basées na céramide (GSL) na membrane ya plasma e déclenchaka agrégation ya GSL ya munene, ematisaka séparation ya phase mpe esalaka déformation ya membrane mpe internalisation ( 44 ). Iwabuchi etc. (43) Emonanaki ete na bozali ya ba chaînes acyliques milayi (C24) kasi ya mokuse te (C16), ligand multivalent oyo ekangami na lactosylcéramide ya GSL e induire formation ya ba clusters ya minene mpe invagination ya membrane, mpe transduction ya signal médiée par cytoplasme Lyn na ba feuilles ezali interdigitée na ba chaînes acyliques oyo ekangami ba neutrophiles oyo babengi neutrophiles.
Na ba cellules épithéliales polarisées ya ba mamans, concentration ya réseau anti-Golgi (TGN) na niveau ya membrane plasmatique apical e contrôler séparation mpe triage ya GPI-AP ( 10 , 45 ). Agrégation oyo ezo dirigé na oligomérisation ya GPI-AP ( 36 ), kasi ekoki pe ko dépendre na longueur ya chaîne céramide oyo tokutaka na levure. Atako GPI-AP ya banyama oyo ememaka mabɛlɛ ezali na ancre oyo esalemi na lipide éther, mpe structure chimique na yango ekeseni mpenza na céramide ya monyololo ya acyle oyo ezali molai mpenza, boyekoli moko oyo euti kosalema kala mingi te emonisi ete ba lipide nyonso mibale ezali na bizaleli ya physique mpe ya chimique oyo ekokani na évolution Mpe mosala ( 40 ). Na yango, eteni ya lipide éther na baselile ya banyama oyo ememaka mabɛlɛ ekoki kokokana na céramide C26 oyo ezali na levure, mpe mokumba na yango ezali ya kosangana na céramide ya monyololo milai na kati ya membrane mpo na kolendisa kosangisa mpe kokabola GPI-AP. Atako esengeli naino komekama mbala moko likoki yango, makambo oyo bamoni liboso endimisi ete komema céramide ya monyololo ya acyle ya molai na nzoto ya Golgi esalemaka te na baproteini ya transfert cytoplasmique, kasi etali synthèse ya ba ancres ya GPI lokola levure. Na yango, emonani ete mécanisme conservateur évolutionnaire ezali na makoki ya ko co-transporter sélectivement céramide ya chaîne acyle très longue mpe GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) na vésicules ya transport moko.
Na ba systèmes ya ba cellules épithéliales polarisées ya levure mpe ya ba mamans, agrégation mpe séparation ya GPI-AP na ba protéines mosusu ya membrane plasmatique nionso esalemaka avant ekoma na surface ya cellule. Paladino mpe bato mosusu. (48) bamonaki ete na TGN ya ba cellules épithéliales polarisées ya ba mamans, clustering ya GPI-AP ezali kaka te na ntina mpo na classification sélective ya ba GPI-APs na membrane plasmatique apical, kasi ezali mpe ko réguler organisation ya clustering ya ba GPI-APs mpe activité biologique na yango. Likolo ya baselile. Na levure, boyekoli oyo elakisaki ete cluster ya GPI-AP oyo etali céramide C26 na ER ekoki ko réguler organisation ya cluster mpe activité fonctionnelle ya GPI-AP na membrane plasmatique ( 24 , 49 ). Na boyokani na modèle oyo, ba cellules GhLag1 ezali allergie na ba inhibiteurs ya GPI to ba kisi oyo e affectaka intégrité ya mur cellulaire ( 28 ), mpe besoin ya ba clusters fonctionnels Gas1-GFP ( 49 ) ya céramide ya pointe oyo e projeter na accouplement ya ba cellules ya levure elakisaka G Possible conséquences physiologiques ya ba cellules hLag1. Libunga ya GPI-AP. Kasi, komeka lisusu soki ebongiseli ya mosala ya likoló ya baselile esalemi na programɛ uta na ER na nzela ya mayele ya kokabola oyo esalemi na kotalela bolai ya lipide ekozala likambo oyo tokosala na mikolo ezali koya.
Ba souches ya Saccharomyces cerevisiae oyo esalelami na mosala oyo ezali na liste na Tableau S1. Ba souches MMY1583 na MMY1635 ya SCLIM pona imagerie ya ba cellules vivantes etongamaki na fond ya W303. Ba souches oyo e exprimaka Sec13-mCherry na étiquette ya proteine ​​fluorescent etongamaki na nzela ya méthode basée na réaction en chaîne ya polymérase (PCR) na plasmide pFA6a lokola modèle ( 23 ). Souche oyo e exprimaka Mid2-iRFP marquée na proteine ​​fluorescente sous contrôle ya promoteur GAL1 etongamaki boye. Amplification ya PCR ya séquence iRFP-KanMx à partir ya vecteur pKTiRFP-KAN (likabo ya E. O’Shea, numéro ya plasmide Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; identifiant ya ressource ya recherche (RRID): Addgene_64687) Mpe ekotisami na C-terminus ya Mid2 endogène. Sima ya ko amplifier séquence ya génome Mid2-iRFP mpe ko cloné na promoteur ya GAL1, e intégré na site Not I-Sac I ya plasmide ya intégration pRS306. Plasmide pRGS7 oyo ezuami e linearisé na Pst I mpo na ko intégrer na locus URA3.
Gène ya fusion Gas1-GFP e exprimer sous contrôle ya promoteur GAL1 na plasmide ya centromère (CEN), oyo etongami boye. Sequence ya Gas1-GFP e amplifier na PCR ewutaki na plasmide pRS416-GAS1-GFP (24) (likabo ya L. Popolo) mpe e cloné na site ya Xma I–Xho I ya plasmide CEN pBEVY-GL LEU2 (likabo ya C) . Miller; Bobakisa plasmide nimero 51225; 10. Boyekoli ya bomoi ya bato na mokili mobimba: 51225; RRID: Bobakisi_51225). Plasmide oyo ezwamaki ezwaki nkombo pRGS6. Gène ya fusion Axl2-GFP e exprimer pe sous contrôle ya promoteur GAL1 ya vecteur pBEVY-GL LEU2, pe construction na yango ezali boye. Sequence Axl2-GFP e amplifier à partir ya plasmide pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) na PCR, mpe e cloné na site ya Bam HI-Pst I ya vecteur pBEVY-GL LEU2. Plasmide oyo ezwamaki ezwaki nkombo pRGS12. Molongo ya ba oligonucléotides oyo esalelami na boyekoli oyo ezali na tableau S2.
Soie yango ebakisami na 0,2% ya adénine mpe 2% ya glucose [YP-dextrose (YPD)], 2% ya raffinose [YP-raffinose] na milieu ya proteine ​​p (YP) oyo ezali na levure riche (1 % ya extrait ya levure mpe 2% ya proteine ​​ept). (YPR)] to 2% ya galactose [YP-galactose (YPG)] lokola source ya carbone, to na milieu minimal synthétique (0,15% base ya azote ya levure mpe 0,5% sulfate d’ammonium) mpo na kobakisa ba acides aminés mpe ba bases oyo ebongi oyo esengeli mpo na nutrition , Mpe ezali na 2% ya glucose (moyen minimal ya glucose synthétique) to 2% ya galactose (moyen minimal synthétique ya galactose) lokola source ya carbone.
Pona imagerie en temps réel, ba cellules mutant sec31-1 sensibles na température oyo e exprimaka construction sous promoteur GAL1 ekolisama na milieu YPR na 24°C butu mobimba tii na phase milieu log. Sima ya induction na YPG na 24°C pendant 1 heure, ba cellules e incuber na SG na 37°C pendant 30 minutes, et puis e transférer na 24°C pona kobimisa na bloc ya sécrétion. Concanavaline A esalelamaki mpo na kobongisa ba cellules na diapositive ya verre mpe ezwaki bilili na nzela ya SCLIM. SCLIM ezali kosangisa microscope ya fluorescence inversée Olympus IX-71 mpe objectif ya mafuta ya ouverture numérique UPlanSApo 100×1.4 (Olympus), scanner confocal ya disque rotatif ya vitesse makasi mpe ya rapport signal-bruit makasi (Yokogawa Electric), spectromètre personnalisé, mpe refroidissement personnalisé Intensificateur ya image ya système (Hamamatsu Photonics) ekoki kopesa système ya lentille magnifique na magnification finale ya ×266,7 mpe caméra ya appareil couplé na charge oyo e multiplier ba électrons (Hamamatsu Photonics) (21). Bozwi bililingi esalemaka na nzela ya logiciel personnalisé (Yokogawa Electric). Mpo na bilili ya 3D, tosalelaki actionneur piézoélectrique oyo esalemaki na kolanda bamposa ya moto mpo na koningana na lentille objectif na verticale, mpe tosangisi biteni ya optique na bokeseni ya 100 nm na kati ya ebele. Image ya Z-stack ebongwanaka na ba données voxel 3D, mpe fonction théorique ya diffusion ya point oyo esalelamaka pona microscope confocal ya disque rotatif esalelamaka pona traitement ya déconvolution na logiciel Volocity (PerkinElmer). Na kosalela logiciel Volocity pona ko seuil automatiquement pona analyse ya co-location, ERES y compris cargo e mezamaki. Analyse ya scanner ya ligne esalemaki na nzela ya logiciel MetaMorph (Molecular Devices).
Salelá logiciel GraphPad Prism mpo na koyeba ntina ya statistiki. Mpo na t-test ya Student ya mikila mibale mpe test ordinaire ya analyse de variance à voie unique (ANOVA), bokeseni kati ya bituluku etalelami lokola ezali na bopusi monene na P <0.05 (*).
Mpo na microscopie ya fluorescence ya Gas1-GFP, ba cellules ya phase log ekolisama butu mobimba na YPD mpe esangisi na centrifugation, esukolamaki mbala mibale na saline tamponnée na phosphate, mpe e incuber na glace au moins 15 minutes, mpe na sima ekendeki na microscope ndenge elobamaki liboso Check (24). Microscope Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 huile PH3 CS) oyo ezali na objectif objectif, filtre L5 (GFP), caméra Hamamatsu mpe logiciel Application Suite X (LAS X) esalemaki mpo na bozui. .
Ba échantillons e dénaturer na tampon ya échantillon SDS na 65°C na boumeli ya 10 minutes, mpe sima ekabolamaki na électrophorèse na gel SDS-polyacrylamide (PAGE). Mpo na analyse immunoblotting, 10 μl ya échantillon e chargeaki na voie moko. Anticorps primaire : Salelá anti-Gas1 polyclonal ya lapin na dilution ya 1:3000, anti-Emp24 polyclonale ya lapin na dilution ya 1:500, mpe anti-GFP polyclonal ya lapin (likabo ya H. Riezman) na dilution ya 1:3000. Anticorps monoclonal anti-Pgk1 ya soso esalelamaki na dilution ya 1:5000 (likabo ya J. de la Cruz). Anticorps secondaire : Immunoglobuline G anti-lapin ya ntaba conjuguée na peroxydase de raisin (HRP) oyo esalemi na dilution ya 1:3000 (Pierce). IgG anti-soso ya ntaba conjugué na HRP esalelamaki na dilution ya 1:3000 (Pierce). Zone ya réponse immunitaire emonanaki na méthode ya chimiluminescence ya réactif SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Ndenge elobami na (31), expérience ya immunoprécipitation naturelle esalemaki na fraction ER enrichie. Na mokuse, kosukola ba cellules ya levure na tampon TNE [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM ya fluorure phénylméthylsulfonyle mpe mélange inhibiteur ya protease) na 600 nm ( OD600) na 100 densité optique mbala mibale. Bazalaki kobuka yango na biliki ya vitre, mpe na nsima bazalaki kolongola biloko ya baselile mpe biliki ya vitre na nzela ya centrifugation. Na nsima, ba centrifugés supernatant na 17.000 g na boumeli ya miniti 15 na 4°C. Ba resuspendu pellet na TNE mpe ba bakisaki saponine digitalis na concentration finale ya 1%. Ba incuber suspension na heure 1 na rotation na 4°C, et puis ba composants insolubles elongolamaki na centrifugation na 13.000 g na 4°C pendant 60 minutes. Mpo na immunoprécipitation ya Gas1-GFP, liboso ko incuber échantillon na ba perles ya agarose ya pamba (ChromoTek) na 4°C na boumeli ya ngonga moko, mpe na nsima ko incuber na GFP-Trap_A (ChromoTek) na 4°C na boumeli ya ngonga 3. Ba perles immunoprécipitées esukolamaki mbala mitano na TNE oyo ezalaki na 0,2% ya digoxigénine, e elué na tampon d’échantillon SDS, ekabolamaki na SDS-PAGE, mpe e analysé na immunoblotting.
Ndenge elobami na (31), détermination ya réticulation esalemaki na fraction ER enrichie. Na mokuse, fraction ER enrichie e incuber na 0,5 mM ya dithiobis(succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 min). Réaction ya réticulation esili na kobakisa glycine (50 mM concentration finale, 5 minutes, 20°C).
Ndenge elobamaki liboso (50), analyse MS ya céramide na ba souches ya type sauvage na GhLag1 esalemaki. Na mokuse, ba cellules ekolisama na phase exponentielle (3 à 4 unités OD600/ml) na YPD na 30°C, mpe ba cellules 25×107 ezuami. Métabolisme na bango esilisaka na acide trichloroacétique. Salelá solvant ya extraction [éthanol, mayi, éther, pyridine mpe hydroxyde d’ammonium 4,2 N (15:15:5:1:0,018 v/v)] mpe 1,2 nmol ya qualité ya céramide C17 standard interne (860517, lipide polaire Avanti). Salelá réactif monométhylamine [méthanol, mai, n-butanol mpe solution ya méthylamine (4:3:1:5 v/v)] mpo na kosala hydrolyse alcaline doux ya extrait, mpe na nsima salelá n-butanol oyo etondi na mai mpo na kosilisa mungwa. Na nsuka, bazongisaki extrait na solvant ya mode positif [chloroforme/méthanol/mai (2:7:1) + 5 mM acétate d’ammonium] mpe ba injecter yango na spectromètre de masse. Monitoring multi-réaction (MRM) esalemaki mpo na identification mpe quantification ya ba molécules ya sphingolipide. Spectromètre de masse quadrupole tertiaire TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) ezali na source robotique ya ba ions nanoflow Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) mpo na analyse ya lipide. Énergie ya collision ezali optimisée pona catégorie moko na moko ya céramide. Ba données ya MS ezuami na mode positif. Mpo na réplica biologique moko na moko, signal lipide ezali médiane ya ba mesures misato indépendantes.
Ndenge elobami na (31), ba cellules (800×107) oyo e exprimaka Gas1-GFP esalemaki na immunoprécipitation naturelle. Gas1-GFP oyo epɛtolami ekabolamaki na SDS-PAGE mpe ekɔtisamaki na membrane ya fluorure ya polyvinylidene (PVDF). Bazalaki komonana na miso proteine ​​yango na kokɔtisa PVDF na langi ya moindo amide. Bande Gas1-GFP ekatamaki na PVDF mpe esukolamaki mbala 5 na methanol mpe mbala moko na mayi ya grade ya chromatographie liquide-MS (LC-MS). Na ko incuber bande ya membrane na 500μl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), tampon mpe 500μl ya mélange ya nitrite de sodium 1 M oyo epanzani sika na 37°C na boumeli ya ngonga 3, fraction ya lipide ebimaka na Gas1-GFP mpe e lysé Release of inosine phosphate céramide entre glucosamine na inositol (51). Nsima na yango, basukolaki bande ya membrane mbala minei na mai ya grade LC-MS, bakaukisaki yango na température ya ndako, mpe babombaki yango na atmosphère ya azote na -80°C tii ntango bakotalela yango. Lokola contrôle, échantillon ya pamba ya membrane PVDF esalemaki mpo na expérience moko na moko. Na nsima, batalelaki lipide oyo bazwaki na Gas1-GFP na nzela ya MS ndenge balobeli yango ( 50 ). Na mokuse, ba bandes PVDF oyo ezalaki na GPI-lipide e resuspendu na 75μl ya solvant ya moule négatif [chloroforme/méthanol (1:2) + 5 mM acétate d’ammonium] mpe elekaki ionisation électropulvérisation (ESI)-MRM/MS Analyse ya espèces ya sphingolipide (TSQ Vantage). Na cas oyo, ba données ya MS ezuami na mode ion négatif.
Ndenge tolobaki yango liboso, eteni ya lipide ya ancre ya GPI ekabolamaki na GPI-AP oyo ezali na marque [3H]-inositol ( 16 ). Ba lipide ekabolamaki na nzela ya chromatographie à couche mince na nzela ya système ya solvant (55:45:10 chloroforme-méthanol-0,25% KCl) mpe emonanaki na miso na nzela ya FLA-7000 (Fujifilm).
Ba cellules oyo e exprimaka Gas1-GFP (600×107) esukolamaki mbala mibale na tampon TNE na tampon TNE, mpe ebukamaki na ba perles ya verre, mpe sima e centrifugé mpo na kolongola ba débris ya ba cellules mpe ba perles ya verre. Na nsima, ba centrifugés supernatant na 17.000 g na boumeli ya ngonga moko na 4°C. Ba sukolaki pellet na TNE mpe ba incuber na 1 U PI-PLC (Invitrogen) na TNE oyo ezalaki na 0,2% ya saponine digitalis na ngonga moko na 37°C. Sima ya traitement ya enzyme, balongolaki membrane na centrifugation na 17.000 g na 4°C na boumeli ya 1 heure. Pona ko immunoprécipiter Gas1-GFP, supernatant e incuber na GFP-Trap_A (ChromoTek) na 4°C butu mobimba. Gas1-GFP purifié oyo ekabolamaki na SDS-PAGE e taché na bleu brillant Coomassie. Bande ya coloration Gas1-GFP ekatamaki na gris oyo ezingaki aqueduct, mpe na sima sima ya alkylation na iodoacétamide mpe réduction na dithiothréitol, digestion in-gel na trypsine esalemaki. Kolongola mpe kokaukisa ba peptides tryptiques mpe ba peptides na ba GPI-glycans. Peptide oyo ekauki epanzani na 20 μl ya mayi. Injecter eteni moko (8μl) na LC. Basalelaki colonne ya octadecylsilane (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; diamètre ya kati 150 mm×1,0 mm; Nomura Chemical, Préfecture ya Aichi, Japon) mpo na kokabola ba peptides na ba conditions spécifiques ya gradient. Phase mobile ezali solvant A (0,08% acide formique) na solvant B (0,15% acide formique na 80% acétonitrile). Système ya Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) esalelamaki mpo na ko eluer colonne na solvant A na kati ya 55 minutes na débit ya 50 μl min-1 na 5 minutes, mpe na sima concentration ya solvant B ematisami na 40%. , États-Unis). Eluate ekotisama ntango nyonso na source ya ba ions ESI, mpe ba peptides tryptiques mpe ba peptides oyo ezali na ba GPI-glycans e analysé na LTQ Orbitrap XL (spectromètre de masse hybride linéaire ion trap-orbitrap; Thermo Fisher Scientific). Na setup ya MS, tension ya source capillaire etiamaki na 4,5 kV, mpe température ya capillaire ya transfert ekangamaki na 300°C. Tension capillaire mpe tension ya lentille ya tube etiamaki na 15 V mpe 50 V, respectivement. Ba données ya MS ezuami na mode ion positif (résolution ya 60.000; précision ya masse ya 10 parties par million) na intervalle ya masse ya 300/m/z rapport masse/charge (m/z) 3000. Ba données ya MS/MS ezuami na nzela ya piège ionique na Orbitrap XL LTQ [ba chiffres 3 ya liboso oyo ba données etali, dissociation induite na collision (CID)].
Ba simulation MD esalemaki na nzela ya logiciel GROMACS (52) na champ de force MARTINI 2 (53-55). Na sima basalelaki CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) pona kotonga bilacouche oyo ezali na dioléoylphosphatidylcholine (DOPC) na Cer C18 to DOPC na Cer C26. Topologie na ba coordonnées ya Cer C26 ezuami na DXCE na kolongola ba perles supplémentaires na mokila ya sphingosine. Salelá processus oyo elimbolami awa na se mpo na ko équilibrer couche double mpe kosala yango, sima salela ba coordonnées ya suka ya système mpo na kotonga système oyo ezali na Emp24. Domaine transmembrane ya levure Emp24 (résidus 173 à 193) etongamaki lokola α-hélice en utilisant visuel MD (VMD) outil structure moléculaire (58). Na nsima, nsima ya kolongola ba lipide oyo ezipamaki, ba granulé proteine ​​yango na ndenge ya mabe mpe batyaki yango na bilayer na nzela ya CHARMM GUI. Système ya suka ezali na 1202 DOPC na 302 Cer C26 to 1197 DOPC na 295 Cer C18 na Emp24. Ioniser système na concentration ya 0,150M. Ba réplicas minei indépendantes esalemaki mpo na ba compositions bilayer mibale.
Bilayer ya lipide ezali équilibré na nzela ya processus CHARMM GUI, oyo esangisi ko minimiser mpe sima ko équilibrer 405.000 étapes, esika ba contraintes ya position ekitisami mokemoke mpe elongolami, mpe étape ya temps emati de 0,005 ps à 0,02 ps. Sima ya équilibre, ebimisaka 6 μs na étape ya temps ya 0,02 ps. Sima ya ko kotisa Emp24, salela processus moko ya CHARMM GUI pona ko minimiser pe ko équilibrer système, pe sima tambola pendant 8 s na production.
Pona ba systèmes nionso, na tango ya procédé ya équilibre, pression e contrôlaka na barostat ya Berendsen (59), pe na tango ya production, pression e contrôlé na barostat Parrinello-Rahman (60). Na ba cas nionso, pression moyenne ezali 1 bar mpe schéma ya couplage ya pression semi-isotrope esalemi. Na procédé ya équilibre na production, thermostat (61) na recalibration ya vitesse esalemaka pona ko coupler température ya ba particules ya proteine, lipide na solvant respectivement. Na boumeli ya opération mobimba, température cible ezali 310K. Interaction non liaison e calculer na ko générer liste ya pairing na nzela ya schéma Verlet na tolerance ya tampon 0,005. Terme ya Coulomb e calculer na nzela ya champ ya réaction na distance ya coupe ya 1,1 nm. Terme ya Vander Waals esalelaka schéma ya kokata na distance ya kokata ya 1,1 nm, mpe schéma ya bokati ya Verlet esalelami mpo na dérive potentielle (62).
Na kosalelaka VMD, bolai ya mbonge ya kokata kati na ba perles ya phosphate DOPC to ba perles ya céramide AM1 mpe proteine ​​ezali 0,7 nm, mpe motango ya ba lipide oyo esalaka na proteine ​​etangami. Engebene na formule oyo elandi, sala calcul ya facteur ya dépletion-enrichissement (DE) lokola na (63): Facteur DE = (motango ya ba lipide totale na proteine ​​0,7) na proteine ​​0,7 (quantité ya Cer na ba lipide totale) .
Valeur oyo elobami ezuami lokola moyenne, pe ba barres ya erreur ezali ba copies minei indépendantes ya SE. Signification statistique ya facteur DE ezuami na test t [(moyenneDE-facteur-1)/SE]. Bosala calcul ya valeur ya P na distribution ya mokila moko.
Esaleli ya GROMACS esalelamaki pona kosala calcul ya carte ya densité latérale 2D ya système oyo ezali na Emp24 na kati ya 250 ns ya suka ya trace. Pona kozua carte ya enrichissement/dépletion ya céramide, carte ya densité ya Cer ekabolami na somme ya carte ya Cer na DOPC, pe sima ekabolami na concentration ya Cer na nzoto. Basalelaka échelle ya karte ya langi ndenge moko.
Mpo na biloko ya kobakisa mpo na lisolo oyo, talá http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
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Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Pérez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Lopez), Miho Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
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©2020 Lisanga ya Amerika mpo na botomboli mayele ya siansi. makoki nyonso mazali ya yo. AAAS ezali partenaire ya HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef mpe COUNTER. Bokoli ya siansi ISSN 2375-2548.