Lisolo yango ezali na kati ya motó ya likambo ya bolukiluki “Kobongisa résistance ya ba légumineuses na ba pathogènes mpe ba peste”, tala masolo nyonso 5
Agent causal ya nécrose ya bokono ya milona ya ba champignons Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary esalelaka stratégie ya niveau ebele pona ko infecter ba plantes hôtes différentes. Boyekoli oyo epesi likanisi ya kosalela diamine L-ornithine, acide aminé oyo ezali na proteine ​​te oyo elamusaka synthèse ya ba acides aminés mosusu ya ntina, lokola mayele mosusu ya boyangeli mpo na kotombola biyano ya moléculaire, physiologique mpe biochimique ya Phaseolus vulgaris L. na moule ya pembe oyo euti na Pseudomonas sclerotiorum. Ba expériences in vitro elakisaki que L-ornithine e inhiber significativement croissance mycéliale ya S. pyrenoidosa na ndenge oyo etali dose. Lisusu, ekokaki kokitisa mpenza makasi ya molinga ya mpɛmbɛ na ntango oyo ezali na serre. Lisusu, L-ornithine elamusaki bokoli ya banzete oyo ezwaki nkisi, yango emonisaki ete ba concentrations ya L-ornithine oyo emekamaki ezalaki phytotoxique te mpo na banzete oyo ezwaki nkisi. En plus, L-ornithine ematisaki expression ya ba antioxydants non enzymatiques (ba phénoliques solubles totales na ba flavonoïdes) na ba antioxydants enzymatiques (catalase (CAT), peroxydase (POX), na polyphénol oxidase (PPO)), mpe ematisaki expression ya ba gènes misato oyo etali antioxydants (PvCAT1, PvSOD, na PvGR). Lisusu. (PlOAH) na oyo etali analyse fonctionnelle, ba domaines conservés, pe topologie. Likambo ya kokamwa, kobakisa L-ornithine na milieu ya bouillon ya dextrose ya pomme de terre (PDB) ekitisaki mingi expression ya gène SsOAH na mycélia ya S. sclerotiorum. Ndenge moko mpe, bosaleli ya L-ornithine na ndenge ya exogène ekitisaki mingi expression ya gène ya SsOAH na ba mycélies ya ba champignons oyo ezuami na ba plantes traitées. Na suka, bosaleli ya L-ornithine ekitisaki mingi sécrétion ya acide oxalique na milieu ya PDB mpe na nkasa oyo ezwami na bokono. Mpo na kosukisa, L-ornithine ezali na mokumba monene mpo na kobatela ezalela ya redox mpe lisusu kotombola eyano ya bobateli ya banzete oyo ezwami na bokono. Ba résultats ya études oyo ekoki kosalisa na kosala ba méthodes ya sika, oyo ekobebisa zinga zinga pona kopekisa moule ya pembe pe kokitisa impact na yango na production ya haricots pe milona misusu.
Moule ya pembe, oyo eyaka na champignon nécrotrophique Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, ezali bokono ya kobebisa, oyo ekitisaka mbuma oyo ezali likama makasi pona bokeli ya haricots (Phaseolus vulgaris L.) ya mokili mobimba (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum ezali moko ya ba pathogènes ya milona ya ba champignons oyo ezwamaka na mabele oyo ezali mpasi mingi mpo na kopekisa, na ba hôtes ya monene ya ba espèces ya milona koleka 600 mpe makoki ya ko macérar noki ba tissus hôtes na ndenge ya spécifique te (Liang na Rollins, 2018). Na ba conditions ya mabe, ezo passer phase critique ya cycle de vie na yango, etikalaka dormant na ba périodes milayi lokola ba structures ya noir, ya makasi, ya ndenge ya mboto oyo babengi ‘sclerotia’ na mabele to lokola ba croissances ya pembe, ya mobulumobulu na mycélium to pith ya tige ya ba plantes infectées (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum ezali na makoki ya kosala sclérotie, oyo epesaka yango nzela ya kobika na bilanga oyo ezwami na bokono na boumeli ya ntango molai mpe kowumela na tango ya bokono (Schwartz et al., 2005). Sclérotie ezali na biloko mingi ya kolia, ekoki kowumela na mabele tango molayi, pe esalaka lokola inoculum ya liboso pona ba infections oyo elandi (Schwartz et al., 2005). Na ba conditions ya malamu, ba sclérotiques ebimaka pe ebimisaka ba spores oyo ezali na mopepe oyo ekoki ko infecter ba parties nionso ya likolo ya mabele ya molona, ​​y compris kasi esuka te na ba fleurs, ba tiges, to ba gousses (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum esalela mayele ya ba niveaux ebele mpo na kopesa bokono na milona oyo eyambaka yango, oyo esangisi molɔngɔ ya makambo oyo ebongisami kobanda na kobima ya sclérotie tii na bokoli ya bilembo. Na ebandeli, S. sclerotiorum ebimisaka ba spores suspendus (oyo babengaka ba ascospores) na ba structures oyo ezali lokola nguba oyo babengi apothecia, oyo ekomaka na mopepe mpe ekomi sclérotie non motile na ba débris ya milona oyo ezwami na bokono (Bolton et al., 2006). Na sima, champignon ebimisaka acide oxalique, facteur virulence, pona ko contrôler pH ya mur cellulaire ya milona, ​​ko promouvoir dégradation enzymatique pe invasion ya tissus (Hegedus na Rimmer, 2005), pe ko supprimer explosion oxidative ya plant hôte. Processus oyo ya acidification e lembisaka mur cellulaire ya milona, ​​epesaka environnement ya malamu pona fonctionnement normal pe efficace ya ba enzymes dégradantes ya mur cellulaire ya ba champignons (CWDEs), epesaka nzela na pathogène elonga barrière physique pe ekota na ba tissus hôtes (Marciano et al., 1983). Soki ekɔti na kati, S. sclerotiorum ebimisaka motángo ya ba CWDE, lokola polygalacturonase mpe cellulase, oyo esalaka ete epalangana na yango na ba tissus oyo ezali na mikrobe mpe esalaka ete misisa ekóma nécrose. Bokoli ya ba lésions na ba tapis hyphales ememaka na ba symptômes caractéristiques ya moule ya pembe (Hegedus na Rimmer, 2005). Pendant ce temps, ba plantes hôtes eyebi ba modèles moléculaires associés na ba pathogènes (PAMPs) na nzela ya ba récepteurs reconnaissances ya modèle (PRR), e déclenchaka série ya ba événements ya signalisation oyo na suka e activaka ba réponses ya défense.
Atako bambula mingi ya milende ya kopekisa maladi, bozangi ya germoplasme oyo ekoki kobundisa maladi etikali na masangu, lokola na milona mosusu ya mombongo, mpo na résistance, kobika, mpe adaptabilité ya pathogène. Na yango, boyangeli bokono ezali na mikakatano mingi pe esengaka mayele ya kosangisa, ya makambo ebele oyo esangisi bosangani ya misala ya mimeseno, bopesi nzela na bioloji, pe ba fungicides chimiques (O'Sullivan et al., 2021). Kopekisa na nzela ya chimique ya moule ya pembe ezali malamu mingi mpo ete bankisi oyo ebomaka bafongi, soki basaleli yango malamu mpe na ntango oyo ebongi, ekoki kopekisa malamu kopalangana ya maladi yango, kokitisa makasi ya maladi yango, mpe kokitisa mbuma oyo ebunga. Kasi, bosaleli mingi pe botiami motema mingi na ba fongicides ekoki komema na kobima ya ba souches résistantes ya S. sclerotiorum pe kozala na bopusi mabe na ba organismes oyo ezali cible te, santé ya mabele, pe qualité ya mayi (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Yango wana, koluka mayele mosusu oyo ekobebisa ezingelo ekómi likambo ya libosoliboso.
Ba polyamines (PA), lokola putrescine, spermidine, spermine, pe cadaverine, ekoki kozala lokola ba alternatives ya elaka contre ba pathogènes ya milona oyo ezwamaka na mabele, na yango kokitisa mobimba to ndambo ya bosaleli ba fungicides chimiques ya likama (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Na banzete ya likolo, ba PAs esanganaka na ba processus physiologiques ebele esangisi, kasi esuka te na, bokabwani ya ba cellules, différenciation, pe eyano na ba stress abiotiques pe biotiques (Killiny pe Nehela, 2020). Bakoki kosala lokola ba antioxydants, kosalisa ko scavenger ba espèces ya oxygène réactif (ROS), ko maintenir homéostase redox (Nehela na Killiny, 2023), ko induire ba gènes lié na défense (Romero et al., 2018), ko réguler ba voies métaboliques ndenge na ndenge (Nehela na Killiny, 2023), ko moduler ba phytohormones endogènes (Nehela na Killiny, 2023 2019), kosala résistance acquise systémique (SAR), mpe ko réguler ba interactions plant-pathogène (Nehela na Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Ezali na tina ya koyeba ete ba mécanismes spécifiques pe ba rôles ya ba PA na défense ya milona ekeseni engebene na lolenge ya milona, ​​ba pathogènes, pe ba conditions ya zinga zinga. PA oyo ezali mingi na milona ezali biosynthétique na polyamine L-ornithine essentielle (Killiny na Nehela, 2020).
L-ornithine esalaka misala mingi na bokoli mpe bokoli ya milona. Ndakisa, boyekoli ya kala elakisaki ete na loso (Oryza sativa), ornithine ekoki kozala na boyokani na recyclage ya azote (Liu et al., 2018), mbuma ya loso, qualité pe nsolo (Lu et al., 2020), pe eyano ya stress ya mayi (Yang et al., 2000). Lisusu, bosaleli ya L-ornithine na ndenge ya libanda ematisaki makasi tolerance ya kokauka na bitabe ya sukali (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) mpe ekitisaki mpasi ya mungwa na matungulu (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu mpe Çavuşoǧlu, 2021) mpe noix de cajou (Anacardium occidentale) . milona (da Rocha mpe basusu, 2012). Role potentiel ya L-ornithine na défense ya stress abiotique ekoki kozala mpo na implication na yango na accumulation ya proline na ba plantes traitées. Ndakisa, ba gènes oyo etali métabolisme ya proline, lokola ba gènes ya ornithine delta aminotransferase (delta-OAT) mpe proline déhydrogénase (ProDH1 mpe ProDH2), elobamaki liboso ete ezali na kati ya bobateli ya Nicotiana benthamiana mpe Arabidopsis thaliana na ba souches ya Pseudomonas syringae oyo ezali hôte te (Senthil-Kumar mpe Mysore, na 2012). Epayi mosusu, ornithine décarboxylase (ODC) ya ba champignons esengeli mpo na bokoli ya ba pathogènes (Singh et al., 2020). Ko cibler ODC ya Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici via silencing génétique induite par hôte (HIGS) ematisaki mingi résistance ya milona ya tomate na Fusarium wilt (Singh et al., 2020). Kasi, rôle potentiel ya application ya ornithine exogène contre ba stress biotiques lokola ba phytopathogènes ezuami malamu te. Likambo ya motuya mingi koleka, bopusi ya ornithine na bokasi ya bokono mpe makambo ya biochimique mpe physiologique oyo esangisi yango etikali mingi mingi naino te.
Kososola complexité ya infection ya S. sclerotiorum ya ba légumineuses ezali important pona développement ya ba stratégies efficaces ya contrôle. Na boyekoli oyo, tozalaki na mokano ya koyeba rôle potentiel ya diamine L-ornithine lokola facteur clé na ko améliorer ba mécanismes ya défense mpe résistance ya ba plantes légumineuses na infection ya Sclerotinia sclerotiorum. Tozali kosala hypothèse que, en plus ya ko améliorer ba réponses ya défense ya ba plantes infectées, L-ornithine e jouaka pe rôle clé na maintien ya état ya redox. To proposer que ba effets potentiels ya L-ornithine ezali lien na régulation ya ba mécanismes ya défense antioxydants enzymatiques na non enzymatiques mpe na interférence na ba facteurs pathogénicité/virulence ya ba champignons na ba protéines associées. Fonctionnalité double oyo ya L-ornithine ekomisi yango candidat elaka pona stratégie durable pona ko mitiger impact ya moule ya pembe pe ko améliorer résistance ya milona ya légumineuse communes na pathogène oyo ya makasi ya champignon. Ba résultats ya études oyo ekoki ko aider na développement ya ba méthodes ya sika, oyo ekobebisa te zinga zinga pona ko contrôler moule ya pembe pe ko mitiger impact na yango na production ya légumineuse.
Na boyekoli oyo, lolenge moko ya mbuma ya momesano oyo ekoki kozwama na mombongo, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), esalelamaki lokola biloko ya komeka. Mboto ya malamu epesamaki na boboto nyonso na Departema ya bolukiluki ya légume, Institut ya bolukiluki ya milona ya bilanga (FCRI), Centre ya bolukiluki ya bilanga (ARC), Egypte. Mboto mitano elonamaki na ba nzungu ya plastique (diamètre ya kati 35 cm, bozindo 50 cm) oyo etondi na mabele oyo ezwami na S. sclerotiorum na conditions ya serre (25 ± 2 °C, humidité relative 75 ± 1%, 8 h lumière/16 h molili). Na mikolo 7–10 sima ya kolona (DPS), ba milona ekitisaki mpo na kotika kaka milona mibale na bokoli ya ndenge moko mpe nkasa misato oyo epanzani mobimba na nzungu moko na moko. Milona nyonso ya nzungu ezalaki komwangisa mai mbala moko nsima ya pɔsɔ mibale mpe kopesa yango elɛngi sanza na sanza na mbangu oyo esɛngamaki mpo na lolenge oyo epesami.
Mpo na kobongisa 500 mg/L ya L-ornithinediamine (eyebani mpe na nkombo (+)-(S)-2,5-acide diaminopentanoïque; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Allemagne), 50 mg epanzani liboso na 100 mL ya mai distillé stérile. Na nsima, ba dilué solution ya stock mpe basalelaki yango na ba expériences oyo elandaki. Na mokuse, bamekaki série motoba ya ba concentrations ya L-ornithine (12,5, 25, 50, 75, 100, mpe 125 mg/L) in vitro. En plus, mayi distillé stérile esalelamaki lokola contrôle négatif (Mock) mpe fungicide commercial “Rizolex-T” 50% poudre mouilable (toclofos-méthyl 20% + thiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Governorate, Egypt) esalelamaki lokola contrôle positif. Fungicide ya mombongo “Rizolex-T” emekamaki in vitro na ba concentrations mitano (2, 4, 6, 8 mpe 10 mg/L).
Ba échantillons ya matiti ya masangu ya momesano mpe ba gousses oyo ezali kolakisa bilembo ya momesano ya mousse ya pembe (taux ya infestation : 10–30%) ezwamaki na bilanga ya mombongo. Atako mingi ya biloko ya milona oyo ezwami na bokono emonanaki na lolenge/lolenge (lolenge ya mombongo oyo ekoki kozwama na yango Giza 3), misusu, mingi mingi oyo ezwamaki na bazando ya mboka, ezalaki ya lolenge oyo eyebani te. Ba matières infectées oyo esangisi e désinfecter liboso na surface na solution ya hypochlorite de sodium 0,5% na boumeli ya 3 minutes, sima e sukolamaki mbala ebele na mayi distillé stérile mpe epangusamaki na papier filtre stérile mpo na kolongola mayi oyo eleki. Na sima ba organes infectés ekatamaki na biteni mike uta na tissus ya kati (kati ya ba tissus ya santé mpe infecté), e cultivé na milieu ya agar dextrose ya pomme de terre (PDA) mpe e incuber na 25 ± 2 °C na cycle ya lumière 12 h/12 ​​h ya molili pendant 5 jours mpo na ko stimuler formation ya sclérotie. Méthode ya pointe mycéliaire esalelamaki mpe mpo na ko purifier ba isolé ya ba champignons oyo ewutaki na ba cultures mélangées to contaminées. Isolé ya champignon purifié e identifier liboso na kotalaka ba caractéristiques morphologiques culturelles na yango pe sima e confirmer que ezali S. sclerotiorum sur la base ya ba caractéristiques microscopiques. Na suka, ba isolé nionso purifiés emekamaki pona pathogénicité na cultivar ya haricots communs susceptibles Giza 3 pona kokutana na ba postulats ya Koch.
En plus, isolé ya S. sclerotiorum oyo e invasive mingi (isolate #3) e confirmer lisusu en base ya séquençage ya espaceur transcrit interne (ITS) ndenge elobami na White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Na mokuse, ba isolé e cultivé na bouillon ya dextrose ya pomme de terre (PDB) mpe e incuber na 25 ± 2 °C na mikolo 5–7. Na nsima, bazalaki kosangisa mycélium ya champignon, kopɛtola yango na elamba ya fromage, kosukola yango mbala mibale na mai oyo ezali na mikrobe te, mpe kokaukisa yango na papye ya kopɛtola biloko oyo ezali na mikrobe te. ADN génomique e isolé na nzela ya Kit ya Miniprep ya ba champignons/bactériens Quick-DNATM (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). Na sima e amplifier région ya rADN ya ITS na nzela ya paire spécifique ya primer ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; taille prévue: 540 bp) ( Baturo-Ciesniewska et al., 2017 ). Ba produits ya PCR purifiés epesamaki pona séquençage (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Ba séquences ya rADN ya ITS esalemaki na séquence bidirectionnelle na nzela ya méthode ya séquençage ya Sanger. Na sima bakokanisaki ba séquences ya requête oyo esangisi na ba données ya sika na GenBank pe na Centre national d’information ya biotechnologie (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) na nzela ya logiciel BLASTn. Sequence ya requête ekokanisi na ba souches/isolés mosusu ya S. sclerotiorum 20 oyo ezuami na ba données ya sika na NCBI GenBank (Tableau supplémentaire S1) na kosalelaka ClustalW na Package ya Analyse Génétique Evolutionnaire Moléculaire (MEGA-11; version 11) (Kumar et al., 2024). Analyse évolutionnaire esalemaki na nzela ya méthode ya probabilité maximale mpe modèle général ya substitution nucléotidiques réversible par temps (Nei na Kumar, 2000). Nzete oyo ezali na log-likelihood ya likolo elakisami. Nzete ya ebandeli pona boluki heuristic eponami na kopona nzete oyo ezali na log-likelihood ya likolo kati ya nzete ya bosangisi ya voisin (NJ) (Kumar et al., 2024) pe nzete ya parsimonie maximale (MP). Nzete ya NJ etongamaki na kosalelaka matrice ya distance ya mibale mibale oyo ezuami na nzela ya modèle général réversible ya tango (Nei na Kumar, 2000).
Activité antibactérienne ya L-ornithine na bactéricide “Rizolex-T” ezuami in vitro na méthode ya diffusion ya agar. Méthode : Kozua quantité oyo esengeli ya solution stock ya L-ornithine (500 mg/L) pe kosangisa yango malamu na 10 ml ya milieu nutriment PDA pona kobongisa ba solutions na ba concentrations finales ya 12,5, 25, 50, 75, 100 pe 125 mg/L, respectivement. Ba concentrations mitano ya fungicide “Rizolex-T” (2, 4, 6, 8 mpe 10 mg/L) mpe mayi distillé stérile esalelamaki lokola contrôle. Sima ya ko solidifier milieu, bouchon mycélique oyo ewutaki kobongisama ya culture ya Sclerotinia sclerotiorum, ya diamètre 4 mm, e transférer na centre ya saani ya Pétri mpe e cultivé na 25±2°C tiii tango mycélium ekozipa plat Pétri témoin mobimba, sima na yango bokoli ya ba champignons ekomaki. Bosala calcul ya inhibition ya pourcentage ya croissance radiale ya S. sclerotiorum na nzela ya équation 1:
Expérience ezongelamaki mbala mibale, na ba réplicas biologiques motoba pona groupe témoin/expérimental moko moko pe ba nzungu mitano (milona mibale na nzungu moko) pona ba réplicas biologiques moko moko. Replicat biologique moko moko e analysé mbala mibale (deux réplicas techniques) pona ko assurer précision, fidélité pe reproductibilité ya ba résultats ya expérimentation. En plus, analyse ya régression ya probit esalemaki pona ko calculer concentration inhibitrice demi-maximale (IC50) na IC99 (Prentice, 1976).
Mpo na kotala makoki ya L-ornithine na ba conditions ya serre, ba expériences mibale ya poto oyo elandana esalemaki. Na mokuse, batondisaki nzungu na mabele ya zelo ya mabele ya lima oyo ekómi stérilisé (3:1) mpe batyaki yango nzungu na culture ya S. sclerotiorum oyo euti kobongisama. Ya liboso, isolé ya S. sclerotiorum oyo e invasive mingi (isolate #3) e cultivé na kokata sclérotium moko na kati, kotia yango elongi na se na PDA mpe ko incuber na 25°C na molili ya ntango nyonso (24 h) na boumeli ya mikolo 4 mpo na ko stimuler croissance mycéliale. Na sima ba bouchons minei ya agar ya diamètre 5 mm ezuami na bord ya liboso mpe e inoculer na 100 g ya mélange stérile ya blé na bran ya loso (1:1, v/v) mpe ba flacons nionso e incuber na 25 ± 2 °C na cycle ya 12 h lumière/12 h ya molili na boumeli ya mikolo 5 mpo na ko stimuler formation ya sclérotie. Makambo oyo ezalaki na kati ya ba flacons nyonso esangisamaki malamu mpo na kosala ete ezala homogénéité liboso ya kobakisa mabele. Na sima, 100 g ya mélange ya bran colonisateur ebakisami na nzungu moko na moko mpo na ko assurer concentration constante ya ba pathogènes. Ba nzungu oyo ba inoculés esopamaki mayi mpo na ko activer croissance ya ba champignons mpe etiemaki na conditions ya serre pendant 7 jours.
Na nsima, balonaki mboto mitano ya lolenge ya Giza 3 na nzungu mokomoko. Mpo na ba nzungu oyo esalemi na L-ornithine mpe na fungicide Rizolex-T, mboto oyo e stérilisé ekɔtisamaki liboso na boumeli ya ngonga mibale na kati ya solution aqueuse ya ba composés mibale na concentration finale ya IC99 ya soki 250 mg/L mpe 50 mg/L, respectivement, mpe na nsima ekaukisamaki na mopepe na boumeli ya ngonga moko yambo ya kolona. Epai mosusu, batyaki mboto yango na mai oyo esili kopɛtolama te lokola eloko oyo ekoki kopekisa yango te. Nsima ya mikolo 10, liboso ya komwangisa mai mpo na mbala ya liboso, bazalaki kokitanya milona yango, mpe bazalaki kotika kaka milona mibale ya pɛto na nzungu mokomoko. En plus, pona ko assurer infection ya S. sclerotiorum, ba tiges ya milona ya haricots na étape ya développement moko (10 jours) ekatamaki na ba endroits mibale différents na nzela ya biscuit stérilisé pe pene na 0,5 g ya mélange ya bran colonisateur etiemaki na mpota moko na moko, elandami na humidité makasi pona ko stimuler infection pe bokoli ya bokono na ba plantes nionso oyo e inoculés. Ba usines ya contrôle ezwaki ba blessures ndenge moko mpe quantité moko (0,5 g) ya mélange ya bran stérile, non colonisé etiamaki na kati ya mpota mpe ebatelamaki na humidité makasi mpo na ko simuler environnement mpo na développement ya bokono mpe ko assurer consistance entre ba groupes ya traitement.
Lolenge ya bosalisi : Bazalaki kosopela milona ya masangu mai na 500 ml ya solution aqueuse ya L-ornithine (250 mg/l) to fungicide Rizolex-T (50 mg/l) na kosopela mabele mayi, sima bazongelaki traitement mbala misato na intervalle ya mikolo 10. Ba témoins oyo bazwaki traitement na placebo ba irrigés na 500 ml ya mayi distillé stérile. Ba traitements nionso esalemaki na ba conditions ya serre (25 ± 2°C, 75 ± 1% ya humidité relative, mpe photopériode ya 8 h lumière/16 h molili). Ba nzungu nionso epesamaki mayi poso mibale na poso mibale mpe esalamaki sanza na sanza na engrais équilibré NPK (20-20-20, na 3,6% ya soufre mpe ba microéléments TE; Zain Seeds, Egypt) na concentration ya 3–4 g/l na nzela ya pulvérisation foliaire selon ba recommandations ya variété spécifique mpe malako ya fabricant. Soki elobami te, nkasa ya maturite oyo epanzani mobimba (2e mpe 3ème nkasa uta likolo) ezwamaki na réplica biologique moko na moko na 72 h sima ya traitement (hpt), e homogénéisé, esanganaki mpe ebombamaki na -80 °C mpo na ba analyses mosusu esangisi, kasi esuka te na, localisation histochimique in situ ya ba indicateurs ya stress oxidatif, peroxydation lipidique, enzymatique mpe non enzymatique ba antioxydants mpe expression ya ba gènes.
Intensité ya infection ya moule blanc etalemaki poso na poso mikolo 21 sima ya inoculation (dpi) na kosalelaka échelle ya 1–9 (Tableau supplémentaire S2) oyo esalemi na échelle ya Petzoldt na Dickson (1996) oyo ebongisamaki na Teran et al. (2006) (2006). Na mokuse, batalelaki matiti mpe bitape ya banzete ya masangu kobanda na esika oyo bapesaki yango nkisi mpo na kolanda ndenge oyo ba lésions ezali kokende na nzela ya ba internodes mpe ba noeuds. Na sima bamekaki ntaka ya esika ya mpasi uta na esika ya bopesi nkisi kino na esika ya mosika koleka pembeni ya lititi to etape mpe bapesaki bapwɛ́ ya 1–9 na kotalela esika oyo mpasi yango ezali, epai (1) elakisaki ete infection oyo emonanaka te pene na esika ya bopesi nkisi mpe (2–9) elakisaki bomati mokemoke ya bonene ya mpasi mpe bokoli na nzela ya ba noeuds/internodes (Tableau supplémentaire S2). Na nsima, babongoli makasi ya bokono ya moule ya pembe na pourcentage na kosalelaka formule 2:
En plus, etando oyo ezali na se ya courbe ya progression ya bokono (AUDPC) e calculer na nzela ya formule (Shaner na Finney, 1977), oyo euti ko adapter pona kopɔla ya pembe ya haricot commun (Chauhan et al., 2020) na kosalelaka équation 3:
Epayi wapi Yi = makasi ya bokono na tango ti, Yi+1 = makasi ya bokono na mbala ya sima ti+1, ti = tango ya bomekoli ya liboso (na mikolo), ti+1 = tango ya bomekoli ya sima (na mikolo), n = motango mobimba ya ba points ya tango to ba points ya observation. Ba paramètres ya bokoli ya milona ya masangu esangisi bosanda ya milona (cm), motango ya bitape na molona moko, pe motango ya nkasa na molona moko ekomamaki poso na poso na boumeli ya mikolo 21 na ba réplicas biologiques nionso.
Na réplica biologique moko na moko, ba échantillons ya nkasa (nkasa ya mibale mpe ya misato oyo ekoli mobimba uta likolo) ezwamaki na mokolo ya 45 sima ya traitement (mikolo 15 sima ya traitement ya suka). Replicat biologique moko na moko ezalaki na ba nzungu mitano (milona mibale na nzungu moko). Pene na 500 mg ya tissu oyo enyatami esalelamaki mpo na kobimisa ba pigments photosynthétiques (chlorophylle a, chlorophylle b mpe caroténoïdes) na kosalelaka 80% ya acétone na 4 °C na molili. Sima ya 24 h, ba échantillons e centrifugés mpe supernatant ezuami pona détermination ya contenus ya chlorophylle a, chlorophylle b na caroténoïde colorimétriquement en utilisant spectrophotomètre UV-160A (Shimadzu Corporation, Japon) selon méthode ya (Lichtenthaler, 1987) na ko mesurer absorbance na ba longueurs d’onde misato différentes (A470, A646 mpe A663 nm). Na suka, contenus ya ba pigments photosynthétiques e calculer na nzela ya ba formules oyo elandi 4–6 oyo Lichtenthaler (1987) alimbolaki.
Na 72 h sima ya traitement (hpt), nkasa (nkasa ya mibale mpe ya misato oyo ekoli mobimba uta likolo) ezwamaki na réplica biologique moko na moko mpo na localisation histochimique in situ ya peroxyde d’hydrogène (H2O2) mpe anion superoxyde (O2•−). Replicat biologique moko na moko ezalaki na ba nzungu mitano (milona mibale na nzungu moko). Replicat biologique moko moko e analysé na double (deux réplicas techniques) pona ko assurer précision, fidélité pe reproductibilité ya méthode. H2O2 mpe O2•− ezwamaki na kosalelaka 0,1% ya 3,3′-diaminobenzidine (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Allemagne) to tétrazolium nitrobleu (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Allemagne), respectivement, kolanda ba méthodes oyo Romero-Puertas et al. (2004) mpe Adam mpe basusu. (1989) na mbongwana ya mikemike. Pona localisation histochimique ya H2O2 in situ, ba feuilles e infiltrer na vide na 0,1% DAB na tampon Tris 10 mM (pH 7,8) et puis e incuber na température ambiante na lumière pendant 60 min. Ba feuilles e blanchir na 0,15% (v/v) TCA na 4:1 (v/v) éthanol:chloroforme (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Caire, Egypte) mpe na sima ba exposer yango na pole tii ekokoma molili. Ndenge moko mpe, ba soupapes e infiltré na vide na tampon phosphate de potassium 10 mM (pH 7,8) oyo ezalaki na 0,1 p/v % ya HBT mpo na localisation histochimique ya O2•− in situ. Ba feuilles e incuber na lumière na température ambiante pendant 20 min, sima e javel lokola likolo, pe sima e éclairer tiii tango ba taches bleu foncé/violet ekobima. Bokasi ya langi ya marron (lokola elembo ya H2O2) to ya bleu-violet (lokola elembo ya O2•−) oyo ezuami etalemaki na kosalelaka version ya Fidji ya ensemble ya traitement ya bilili ImageJ (http://fiji.sc; ezuami le 7 mars 2024).
Malondialdéhyde (MDA; lokola marqueur ya peroxydation ya lipide) e déterminé selon méthode ya Du na Bramlage (1992) na ba modifications ya muke. Nkasa ya réplica biologique moko moko (nkasa ya mibale mpe ya misato oyo ekoli mobimba uta likolo) ezwamaki 72 h sima ya traitement (hpt). Replicat biologique moko na moko ezalaki na ba nzungu mitano (milona mibale na nzungu moko). Replicat biologique moko moko e analysé na double (deux réplicas techniques) pona ko assurer précision, fidélité pe reproductibilité ya méthode. Na mokuse, 0,5 g ya tissus ya nkasa ya mabele esalelamaki mpo na extraction ya MDA na acide trichloroacétique 20% (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) oyo ezalaki na 0,01% ya hydroxytoluène butylé (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Na sima ba déterminer contenu ya MDA na supernatant na colorimétrique na ko mesurer absorbance na 532 na 600 nm na nzela ya spectrophotomètre UV-160A (Shimadzu Corporation, Japon) et puis e exprimer lokola nmol g−1 FW.
Pona botali ba antioxydants non enzymatiques pe enzymatiques, nkasa (nkasa ya mibale pe ya misato oyo ekoli mobimba uta likolo) ezuami na réplica biologique moko moko na 72 h sima ya traitement (hpt). Replicat biologique moko na moko ezalaki na ba nzungu mitano (milona mibale na nzungu moko). Échantillon biologique moko na moko e analysé na double (ba échantillons techniques mibale). Nkasa mibale enyatamaki na azote ya mayi mpe esalelamaki mbala moko mpo na koyeba ba antioxydants enzymatiques mpe non enzymatiques, ba acides aminés totales, contenu ya proline, expression ya ba gènes, mpe quantification ya oxalate.
Ba phénoliques solubles totales ezuami na nzela ya réactif Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) na ba modifications moke ya méthode oyo elobami na Kahkonen et al. (1999) mpe azali. Na mokuse, pene na 0,1 g ya tissus ya nkasa homogénéisé elongolamaki na 20 ml ya methanol 80% na molili na boumeli ya 24 h mpe supernatant ezwamaki sima ya centrifugation. 0,1 ml ya extrait ya échantillon esangani na 0,5 ml ya réactif Folin-Ciocalteu (10%), eningisamaki na boumeli ya 30 s mpe etikami na molili na boumeli ya 5 min. Na sima 0,5 ml ya solution ya carbonate de sodium 20% (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Caire, Egypte) ebakisami na tube moko na moko, esangani malamu mpe e incuber na température ambiante na molili na boumeli ya 1 h. Sima ya incubation, absorbance ya mélange ya réaction emekamaki na 765 nm na nzela ya spectrophotomètre UV-160A (Shimadzu Corporation, Japon). Concentration ya ba phénols solubles totales na ba extraits ya échantillon ezuami na nzela ya courbe ya calibration ya acide gallique (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) mpe elakisami lokola milligrammes ya équivalent ya acide gallique na gramme moko ya poids ya sika (mg GAE g-1 poids frais).
Contenu total ya flavonoïdes solubles ezuami selon méthode ya Djeridane et al. (2006) na mwa mbongwana. Na mokuse, 0,3 ml ya extrait ya méthanol oyo tolobeli awa na likoló esangisamaki na 0,3 ml ya solution ya chlorure d’aluminium 5% (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA), ebalusamaki makasi mpe na nsima ekɔtisamaki na température ambiante na boumeli ya 5 min, na nsima babakisi 0,3 ml ya solution ya acétate de potassium 10% (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Caire, Egypte), esangani malamu mpe e incuber na température ambiante pendant 30 min na molili. Sima ya incubation, absorbance ya mélange ya réaction emekamaki na 430 nm na nzela ya spectrophotomètre UV-160A (Shimadzu Corporation, Japon). Concentration ya ba flavonoïdes solubles totales na ba extraits ya échantillon ezuami na nzela ya courbe ya calibration ya rutine (TCI America, Portland, OR, USA) mpe sima e exprimer lokola milligrammes ya équivalent ya rutine na gramme moko ya poids ya sika (mg RE g-1 poids frais).
Contenu total ya ba acides aminés libres ya nkasa ya haricots ezuami na nzela ya réactif ninhydrine modifié (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) na kotalaka méthode oyo Yokoyama na Hiramatsu (2003) ba proposaki pe e modifier na Sun et al. (2006) (2006). Na mokuse, 0,1 g ya tissu ya mabele elongolamaki na tampon pH 5,4, mpe 200 μL ya supernatant esalemaki na 200 μL ya ninhydrine (2%) mpe 200 μL ya pyridine (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA), e incuber na bain ya mayi ya kotɔka na boumeli ya 30 min, sima e malili mpe emekamaki na 580 nm na kosalelaka spectrophotomètre UV-160A (Shimadzu Corporation, Japon). Epayi mosusu, proline ezwamaki na nzela ya mayele ya Bates (Bates et al., 1973). Ba extraire proline na acide sulfosalicylique 3% (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) mpe sima ya centrifugation, 0,5 ml ya supernatant esangani na 1 ml ya acide acétique glacial (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) mpe réactif ninhydrine, e incuber na 90°C pendant 45 min, e refroidir mpe emekamaki na 520 nm na kosalelaka spectrophotomètre moko na oyo ezali likolo. Ba acides aminés libres totales na proline na ba extraits ya nkasa ezuami na nzela ya ba courbes ya calibration ya glycine na proline (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), respectivement, pe e exprimer lokola mg/g ya poids ya sika.
Mpo na koyeba activité enzymatique ya ba enzymes antioxydantes, ba extraire soki 500 mg ya tissu homogénéisé na 3 ml ya tampon Tris 50 mM (pH 7,8) oyo ezali na 1 mM ya EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) mpe 7,5% ya polyvinylpyrrolidone (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), centrifugé na 10.000 × g pendant 20 min sous réfrigération (4 °C), pe supernatant (extrait ya enzyme brut) ezuami (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Na sima ba réagir catalase (CAT) na 2 ml ya tampon phosphate de sodium 0,1 M (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) mpe 100 μl ya solution ya H2O2 269 mM mpo na koyeba activité enzymatique na yango selon méthode ya Aebi (1984) na ba modifications ya moke (El-Nagar et al., 2023; Osman mpe basusu, 2023). Activité enzymatique ya peroxydase dépendante ya guaiacol (POX) ezuami na nzela ya méthode ya Harrach et al. (2009) mpe basusu. (2008) na ba modifications ya mike mike (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) mpe activité enzymatique ya polyphénol oxidase (PPO) ezuami sima ya réaction na 2,2 ml ya tampon phosphate de sodium 100 mM (pH 6,0), 100 μl ya guaiacol (chimiques TCI, Portland, OR, USA) mpe 100 μl ya 12 mM H2O2. Méthode ebongisamaki mwa moke uta na (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Test esalemaki sima ya réaction na 3 ml ya solution ya catechol (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0,01 M) oyo ebongisamaki sika na tampon phosphate 0,1 M (pH 6,0). Activité ya CAT e mezamaki na kolandela décomposition ya H2O2 na 240 nm (A240), activité ya POX e mezamaki na ko suivre augmentation ya absorbance na 436 nm (A436), mpe activité ya PPO e mezamaki na enregistrement ya ba fluctuations ya absorbance na 495 nm (A495) chaque 30 s pendant 3 min en utilisant un UV-160A spectrophotomètre (Shimadzu, Japon).
RT-PCR en temps réel esalemaki mpo na koyeba niveau ya transcript ya ba gènes misato oyo etali antioxydants, na kati na yango catalase peroxisomique (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), superoxyde dismutase (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1), mpe glutathione reductase (PvGR; GenBank Accession No. KY195009.1), na nkasa ya masangu (nkasa ya mibale mpe ya misato oyo ekoli mobimba uta likolo) 72 h sima ya traitement ya suka. Na mokuse, ARN elongolamaki na lisalisi ya Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Chine) engebene protocole ya mosali. Na nsima, basalaki ADNc na lisalisi ya TOP scriptTM CDNA Synthesis Kit engebene malako ya mosali. Ba séquences ya ba primers ya ba gènes misato oyo ezali likolo ezali na liste na Tableau supplémentaire S3. PvActin-3 (numéro d’accession GenBank: XM_068616709.1) esalelamaki lokola gène ya bobateli ndako mpe expression ya gène relative e calculer na nzela ya méthode 2-ΔΔCT (Livak na Schmittgen, 2001). Stabilité ya actine na se ya stress biotique (interaction incompatible entre ba légumineuses communes na champignon anthracnose Colletotrichum lindemuthianum) na stress abiotique (secheresse, salinité, température basse) elakisami (Borges et al., 2012).
Tosalaki na ebandeli analyse in silico na génome mobimba ya ba proteines ya oxaloacétate acétylhydrolase (OAH) na S. sclerotiorum na kosalelaka esaleli ya BLAST ya proteine-protéine (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Na mokuse, tosalelaki OAH oyo euti na Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; nimero ya accès ya GenBank XP_040799428.1; 342 acides aminés) mpe Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; nimero ya accès ya GenBank XP_056833920.1; BLASTp esalemaki na ba données ya génome ya S. sclerotiorum oyo ezwami kala mingi te na GenBank na site internet ya Centre national d’information biotechnologie (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
En plus, gène ya OAH oyo esakolamaki oyo ewutaki na S. sclerotiorum (SsOAH) pe analyse évolutionnaire pe nzete ya phylogénétique ya AfOAH oyo ewutaki na A. fijiensis CBS 313.89 pe PlOAH oyo ewutaki na P. lagena ezuami na nzela ya méthode ya probabilité maximale na MEGA11 (Tamura et al., 2021) pe modèle basé na matrice JTT (Jones et al., 1992) mpe basusu). Nzete ya phylogénétique esangisamaki na analyse ya alignment multiple ya ba séquences ya proteine ​​ya ba gènes nionso ya OAH oyo esakolamaki (SsOAH) oyo ewutaki na S. sclerotiorum mpe séquence ya requête na nzela ya Outil d’alignment basé sur le contrainte (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos na Agarwala, 2007). En plus, ba séquences ya ba acides aminés oyo ekokani malamu ya SsOAH oyo ewutaki na S. sclerotiorum e aligné na ba séquences ya requête (AfOAH na PlOAH) (Larkin et al., 2007) na nzela ya ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), mpe ba régions conservées na alignment e visualisé na nzela ya outil ESPript (version 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) Ezali na ntina mingi mpo na kozwa yango.
Lisusu, ba domaines représentants fonctionnels prévus mpe ba sites conservés ya S. sclerotiorum SsOAH e classifié interactivement na ba familles différentes na nzela ya esaleli ya InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Na suka, modélisation ya structure à trois dimensions (3D) ya SsOAH ya S. sclerotiorum oyo esakolamaki esalemaki na nzela ya Moteur ya Reconnaissance ya Homologie/Analogy Protéine (Phyre2 server version 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) mpe e validamaki na kosalelaka mosaleli ya SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Ba structures tridimensionnelles prévues (format PDB) ezuami na ndenge ya interactif na nzela ya ensemble UCSF-Chimera (version 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (Pettersen et al., 2004).
PCR quantitative ya fluorescence en temps réel esalemaki pona koyeba niveau ya transcription ya oxaloacétate acétylhydrolase (SsOAH; numéro d’accession GenBank: XM_001590428.1) na mycélies ya Sclerotinia sclerotiorum. Na mokuse, S. sclerotiorum e inoculer na flacon oyo ezalaki na PDB mpe etiemaki na incubateur ya koningana (modèle: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) na 25 ± 2 °C na 24 h na 150 rpm mpe na molili ya ntango nyonso (24 h) mpo na ko stimuler croissance mycéliale. Na sima, ba cellules e traité na L-ornithine na fungicide Rizolex-T na ba concentrations finales ya IC50 (pene na 40 na 3,2 mg/L, respectivement) et puis e cultivé pendant 24 h mosusu na ba conditions moko. Sima ya incubation, ba cultures e centrifugé na 2500 rpm pendant 5 min mpe supernatant (mycélium champignon) ezuami pona analyse ya expression génétique. Ndenge moko mpe, mycélium ya champignon ezwamaki na 0, 24, 48, 72, 96, mpe 120 h sima ya bokono uta na banzete oyo ezwaki bokono oyo esalaki moule ya pembe mpe mycélium ya coton na likolo ya ba tissus oyo ezwami na bokono. Bazalaki kobimisa ARN na mycélium ya ba champignons mpe na nsima bazalaki kosala ADNc ndenge tolobeli yango awa na likoló. Ba séquences ya primers pona SsOAH ezali na liste na Tableau supplémentaire S3. SsActin (numéro d’accession GenBank: XM_001589919.1) esalelamaki lokola gène ya bobateli ndako, mpe expression relative ya gène ezwamaki na nzela ya méthode 2-ΔΔCT (Livak na Schmittgen, 2001).
Acide oxalique ezuami na bouillon ya dextrose ya pomme de terre (PDB) pe na ba échantillons ya milona oyo ezali na pathogène ya champignon Sclerotinia sclerotiorum selon méthode ya Xu na Zhang (2000) na ba modifications ya muke. Na mokuse, ba isolé ya S. sclerotiorum e inoculer na ba flacons oyo ezalaki na PDB mpe sima e cultivé na incubateur ya koningana (modèle I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) na 150 rpm na 25 ± 2 °C pendant 3–5 jours na molili ya constant (24 h) mpo na ko stimuler croissance mycéliale. Sima ya incubation, culture ya ba champignons e filtraki liboso na papier filtrant Whatman #1 mpe sima e centrifugé na 2500 rpm na 5 min mpo na kolongola mycélium oyo etikali. Bazuaki supernatant mpe babombaki yango na 4°C mpo na koyeba lisusu quantitative ya oxalate. Mpo na kobongisa ba échantillons ya milona, ​​pene na 0,1 g ya biteni ya tissus ya milona elongolamaki mbala misato na mayi distillé (2 ml mbala moko). Na sima ba échantillons e centrifugé na 2500 rpm pendant 5 min, supernatant e filtrer sèche na papier filtrant Whatman No. 1 mpe e ramasser pona analyse mosusu.
Pona analyse quantitative ya acide oxalique, mélange ya réaction ebongisamaki na tube ya bouchon en verre na ordre oyo : 0,2 ml ya échantillon (to filtrat ya culture PDB to solution standard ya acide oxalique), 0,11 ml ya bleu bromophénol (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA), 0,198 ml ya acide sulfurique 1 M (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Caire, Egypte) mpe 0,176 ml ya dichromate de potassium 100 mM (K2Cr2O7; ba produits chimiques TCI, Portland, OR, USA), mpe na nsima, ba diluer solution na 4,8 ml na mayi distillé, basangisaki yango makasi mpe batiaki yango mbala moko na mayi ya 60 °C kosokola. Sima ya 10 min, batelemisaki réaction na kobakisa 0,5 ml ya solution ya hydroxyde de sodium (NaOH; 0,75 M). Absorbance (A600) ya mélange ya réaction emekamaki na 600 nm na nzela ya spectrophotomètre UV-160 (Shimadzu Corporation, Japon). PDB pe mayi distillé esalelamaki lokola ba contrôles pona quantification ya ba filtrés ya culture pe ba échantillons ya milona, ​​respectivement. Ba concentrations ya acide oxalique na ba filtrés ya culture, oyo elakisami lokola microgrammes ya acide oxalique na millilitre ya milieu PDB (μg.mL−1), pe na ba extraits ya nkasa, oyo elakisami lokola microgrammes ya acide oxalique na gramme ya poids ya sika (μg.g−1 FW), ezuami na nzela ya courbe ya calibration ya acide oxalique (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA).
Na boumeli ya boyekoli mobimba, ba expériences nionso esalemaki na design totalement randomisé (CRD) na ba replicas biologiques motoba na traitement moko mpe ba nzungu mitano na replication biologique moko (milona mibale na nzungu moko) longola se soki elobami ndenge mosusu. Ba réplicas biologiques e analysé na double (deux réplicas techniques). Ba réplicas techniques esalemaki pona ko vérifier reproductibilité ya expérience moko kasi esalelamaki te na analyse statistique pona ko éviter ba réplicas ya lokuta. Ba données e analysé statistiquement en utilisant analyse de variance (ANOVA) elandami na test ya différence honnêtement significative (HSD) ya Tukey-Kramer (p ≤ 0.05). Pona ba expériences in vitro, ba valeurs ya IC50 na IC99 e calculer na nzela ya modèle ya probit pe ba intervalles ya confiance ya 95% e calculer.
Ba isolé minei ezwamaki na bilanga ndenge na ndenge ya soya na Gouvernement ya El Ghabiya, na Egypte. Na milieu PDA, ba isolé nionso ebimisaki mycélium ya pembe crème oyo ekoma noki pembe cotony (Figure 1A) mpe sima beige to marron na stade ya sclérotium. Mbala mingi ba sclérotie ezalaka dense, noir, sphérique to irregulière na forme, 5,2 à 7,7 mm ya longueur mpe 3,4 à 5,3 mm na diamètre (Figure 1B). Atako ba isolé minei ekolisaki motindo ya marginal ya sclérotie na bord ya milieu ya culture sima ya mikolo 10–12 ya incubation na 25 ± 2 °C (Fig. 1A), motango ya ba sclérotie na plaque moko ekesanaki mingi kati na bango (P < 0.001), na isolé 3 oyo ezalaki na nombre ya sclérotie ya likolo (32,33 ± 1,53 scrotie par plaque 1C). Ndenge moko mpe, isolé #3 ebimisaki acide oxalique mingi na PDB koleka ba isolé mosusu (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; Fig. 1D). Isolate #3 elakisaki bizaleli ya morphologique mpe microscopique typique ya champignon phytopathogène Sclerotinia sclerotiorum. Ndakisa, na PDA, ba colonie ya isolé #3 ekolaki noki, ezalaki pembe ya crème (Figure 1A), beige inverse to jaune-marron ya loso ya pete, mpe esengelaki mikolo 6-7 na 25 ± 2°C mpo na kozipa mobimba likolo ya plaque ya diamètre 9 cm. Na kotalaka bizaleli ya morphologique mpe microscopique oyo tolobeli likolo, isolé #3 e identifier lokola Sclerotinia sclerotiorum.
Figure 1. Bizalela pe bokono ya ba isolé ya S. sclerotiorum oyo euti na milona ya légumineuse oyo emonanaka mingi. (A) Bokoli ya mycélium ya ba isolé minei ya S. sclerotiorum na milieu PDA, (B) sclérotie ya ba isolé minei ya S. sclerotiorum, (C) motango ya sclérotie (na plaque moko), (D) sécrétion ya acide oxalique na milieu PDB (μg.mL−1), mpe (E) makasi ya bokono (%) ya ba isolé minei ya S. sclerotiorum na légume commerciale susceptible cultivar Giza 3 na ba conditions ya serre. Ba valeurs ezali komonisa moyenne ± SD ya ba réplicas biologiques mitano (n = 5). Ba lettres ndenge na ndenge elakisaka bokeseni ya statistiquement significatif entre ba traitements (p < 0.05). (F–H) Ba symptômes typiques ya moule blanc emonanaki na ba tige ya likolo ya mabele mpe na ba siliques, respectivement, mikolo 10 sima ya inoculation na isolé #3 (dpi). . Mituya oyo ezali likolo ya milɔngɔ ya bosangisi elakisi bozipi ya etuka (%), pe mituya oyo ezali na nse ya milɔngɔ ya bosangisi elakisi bolai ya bitape.
Lisusu, pona kondimisa pathogénicité, ba isolé minei ya S. sclerotiorum oyo ezuami esalelamaki pona ko inoculer cultivar ya haricots commercial Giza 3 oyo ekoki kozwama na conditions ya serre, oyo ezali na boyokani na ba postulats ya Koch (Fig. 1E). Atako ba isolé nionso ya ba champignons oyo ezuami ezalaki pathogènes mpe ekokaki ko infecter haricot vert (cv. Giza 3), kopesaka ba symptômes typiques ya moule ya pembe na ba parties nionso ya likolo ya mabele (Fig. 1F), mingi mingi na ba tige (Fig. 1G) mpe na ba gousses (Fig. 1H) na mikolo 10 sima ya inoculation (dpi), isolé 3 ezalaki isolé oyo ezalaki agressif mingi na ba expériences mibale indépendantes. Isolate 3 ezalaki na makasi ya bokono mingi (%) na milona ya masangu (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0, mpe 76,7 ± 3,1 na mikolo 7, 14, mpe 21 sima ya bokono, respectivement; Figure 1F).
Identification ya isolé #3 ya S. sclerotiorum oyo ezo invasive mingi e confirmer lisusu sur la base ya séquençage ya espaceur transcrit interne (ITS) (Fig. 1I). Analyse phylogénétique entre isolé #3 na 20 isolé/souches de référence elakisaki similarité makasi (>99%) entre bango. Ezali na tina ya koyeba ete isolé ya S. sclerotiorum #3 (533 bp) ezali na bokokani makasi na isolé ya S. sclerotiorum ya Amerika LPM36 oyo ezwami na mboto ya pois ya kokauka (numéro d’accession ya GenBank MK896659.1; 540 bp) mpe isolé ya S. sclerotiorum ya Chine YKY211 (numéro d’accessation ya GenBank OR206374.1; Sequence ya sika etiemaki na base de données ya NCBI mpe epesameli kombo « Sclerotinia sclerotiorum – isoler YN-25 » (numéro d’accès ya GenBank PV202792). Ekoki komonana ete isolé 3 ezali isolé oyo ekɔtaka mingi; yango wana, baponaki isolé oyo mpo na koyekola na ba expériences nionso oyo elandaki.
Activité antibactérienne ya diamine L-ornithine (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Allemagne) na ba concentrations différentes (12,5, 25, 50, 75, 100 et 125 mg/L) contre isolé 3 ya S. sclerotiorum 3 e investigamaki in vitro. Ezali na ntina koyeba ete L-ornithine esalaki effet antibactérien mpe mokemoke epekisaki bokoli ya radial ya S. sclerotiorum hyphae na ndenge oyo etali dose (Figure 2A, B). Na concentration ya likolo oyo emekamaki (125 mg/L), L-ornithine elakisaki taux ya inhibition ya croissance mycéliale ya likolo (99,62 ± 0,27%; Figure 2B), oyo ekokani na fungicide ya mombongo Rizolex-T (taux ya inhibition 99,45 ± 0,39%; Figure 2C) na concentration ya likolo oyo emekamaki (10 mg/L), elakisaki ndenge moko efficacité na yango.
Figure 2. Activité antibactérienne in vitro ya L-ornithine contre Sclerotinia sclerotiorum. (A) Kokokanisa activité antibactérienne ya ba concentrations différentes ya L-ornithine contre S. sclerotiorum na fungicide commercial Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Taux ya inhibition (%) ya croissance mycéliale ya S. sclerotiorum sima ya traitement na ba concentrations différentes ya L-ornithine (12,5, 25, 50, 75, 100 et 125 mg/L) to Rizolex-T (2, 4, 6, 8 et 10 mg/L), respectivement. Ba valeurs ezali komonisa moyenne ± SD ya ba réplicas biologiques mitano (n = 5). Ba lettres ndenge na ndenge elakisi bokeseni ya statistique entre ba traitements (p < 0.05). (D, E) Analyse ya régression ya modèle ya Probit ya L-ornithine na fungicide commercial Rizolex-T, respectivement. Line ya régression ya modèle probit elakisami lokola ligne bleu solide, pe intervalle ya confiance (95%) elakisami lokola ligne rouge pointillée.
En plus, analyse ya régression ya probit esalemaki pe ba plots correspondants elakisami na tableau 1 pe ba figures 2D,E. Na mokuse, motuya ya pente oyo endimami (y = 2.92x − 4,67) mpe ba statistiques ya ntina oyo esangisi yango (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 mpe p < 0.0001; Figure 2D) ya L-ornithine elakisaki activité antifongique oyo ebakisami contre S. sclerotiorum soki tokokanisi yango na fungicide ya mombongo Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 mpe p < 0,0001) (Tableau 1).
Tableau 1. Valeurs ya concentration inhibitrice demi-maximale (IC50) na IC99 (mg/l) ya L-ornithine na fungicide commercial “Rizolex-T” contre S. sclerotiorum.
Na mobimba, L-ornithine (250 mg/L) ekitisaki mingi bokoli mpe makasi ya moule ya pembe na milona ya masangu ya momesano oyo esalemi na traitement soki tokokanisi yango na milona oyo ezwami na bokono ya S. sclerotiorum oyo esalemi te (contrôle; Figure 3A). Na mokuse, atako makasi ya bokono ya banzete ya témoin oyo ezwami na bokono oyo ezwami te emati mokemoke (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61, mpe 92,33 ± 3,06%), L-ornithine ekitisaki makasi bokono (%) na boumeli ya bomekoli mobimba (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00, mpe 26,36 ± 3,07) na mikolo 7, 14, mpe 21 sima ya traitement (dpt), respectivement (Figure 3A). Ndenge moko mpe, tango milona ya masangu oyo ezwami na S. sclerotiorum ezwaki lisalisi ya 250 mg/L ya L-ornithine, etando oyo ezali na nse ya courbe ya bokoli ya bokono (AUDPC) ekita uta 1274,33 ± 33,13 na témoin oyo ezwaki lisalisi te kino na 281,03 ± 7,95, oyo ezalaki mwa moke na nse koleka oyo ya témoin positif 50 mg/L Fungicide Rizolex-T (183,61 ± 7,71; Fig. 3B). Momeseno yango moko emonanaki na komeka ya mibale.
Fig. 3. Effet ya application exogène ya L-ornithine na développement ya rot blanc ya haricots communs oyo esalemi na Sclerotinia sclerotiorum na conditions ya serre. (A) Courbe ya progression ya bokono ya moule ya pembe ya haricot commun sima ya traitement na 250 mg/L ya L-ornithine. (B) Etando oyo ezali na nse ya courbe ya progression ya bokono (AUDPC) ya moule ya pembe ya haricot commun sima ya traitement na L-ornithine. Ba valeurs ezali komonisa moyenne ± SD ya ba réplicas biologiques mitano (n = 5). Ba lettres ndenge na ndenge elakisi bokeseni ya statistiquement significatif entre ba traitements (p < 0.05).
Kosalela na libanda ya 250 mg/L L-ornithine ematisaki mokemoke bosanda ya milona (Fig. 4A), motango ya bitape na molona moko (Fig. 4B), mpe motango ya nkasa na molona moko (Fig. 4C) sima ya mikolo 42. Atako fungicide ya mombongo Rizolex-T (50 mg/L) ezalaki na effet monene na ba paramètres nutritionnels nionso oyo bayekolaki, application exogène ya 250 mg/L L-ornithine ezalaki na effet ya mibale ya monene soki tokokanisi yango na ba témoins oyo ezwaki traitement te (Figs. 4A–C). Epayi mosusu, traitement ya L-ornithine ezalaki na effet ya significatif te na contenu ya ba pigments photosynthétiques chlorophylle a (Fig. 4D) na chlorophylle b (Fig. 4E), kasi ematisaki mua moke teneur total ya caroténoïde (0,56 ± 0,03 mg/g fr wt) par rapport na contrôle négatif (0,44 ± 0,02 mg/g fr wt) mpe contrôle positif (0,46 ± 0,02 mg/g fr poids; Fig. 4F). Na mobimba, ba résultats oyo ezo lakisa que L-ornithine ezali phytotoxique te na ba légumineuses traitées mpe ekoki kutu ko stimuler croissance na yango.
Fig. 4. Effet ya application exogène ya L-ornithine na ba caractéristiques ya croissance na ba pigments photosynthétiques ya nkasa ya haricots infectés na Sclerotinia sclerotiorum na conditions ya serre. (A) Bolai ya molona (cm), (B) Motango ya bitape na molona moko, (C) Motango ya nkasa na molona moko, (D) Chlorophylle a oyo ezali na kati (mg g-1 fr wt), (E) Chlorophylle b (mg g-1 fr wt), (F) Motango mobimba ya caroténoïdes (mg g-1 fr wt). Ba valeurs ezali moyenne ± SD ya ba réplicas biologiques mitano (n = 5). Ba lettres ndenge na ndenge elakisaka bokeseni ya statistiquement significatif entre ba traitements (p < 0.05).
Localisation histochimique in situ ya ba espèces ya oxygène réactif (ROS; exprimé lokola peroxyde d’hydrogène [H2O2]) mpe ba radicaux libres (exprimés lokola ba aniions superoxyde [O2•−]) emonisaki que application exogène ya L-ornithine (250 mg/L) ekitisaki makasi accumulation ya H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; Fig. 5A) mpe O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; Fig. 5B) soki tokokanisi yango na bosangisi ya milona nyonso mibale oyo ezwami na bokono oyo ezwami te (173,31 ± 12,06 mpe 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW, respectivement) mpe milona oyo esalemi na 50 mg/L ya fungicide ya mombongo Rizolex-T (170,12 ± 9,50 mpe 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt, respectivement) na 72 h. Niveau ya likolo ya H2O2 na O2•− e accumule na se ya hpt (Fig. 5A, B). Ndenge moko mpe, test ya malondialdéhyde (MDA) oyo esalemi na TCA elakisaki ete milona ya masangu oyo ezwami na S. sclerotiorum e accumule niveau ya MDA ya likolo (113,48 ± 10,02 nmol.g fr wt) na nkasa na yango (Fig. 5C). Kasi, bosaleli ya exogène ya L-ornithine ekitisaki mingi peroxydation ya lipide lokola emonisami na bokiti ya teneur ya MDA na milona oyo esalemi (33,08 ± 4,00 nmol.g fr wt).
Fig. 5. Effet ya application exogène ya L-ornithine na ba marqueurs minene ya stress oxidatif pe ba mécanismes ya défense antioxydante non enzymatique na nkasa ya haricots infectés na S. sclerotiorum na 72 h sima ya infection na conditions ya serre. (A) Peroxyde d’hydrogène (H2O2; nmol g−1 FW) na 72 hpt, (B) anion superoxyde (O2•−; nmol g−1 FW) na 72 hpt, (C) malondialdéhyde (MDA; nmol g−1 FW) na 72 hpt, (D) ba phénols solubles totales (mg GAE g−1 FW) na 72 hpt, (E) ba flavonoïdes solubles totales (mg RE g−1 FW) na 72 hpt, (F) ba acides aminés libres totales (mg g−1 FW) na 72 hpt, mpe (G) teneur ya proline (mg g−1 FW) na 72 hpt. Ba valeurs ezali komonisa moyenne ± écart standard (moyenne ± DS) ya 5 réplicas biologiques (n = 5). Ba lettres ndenge na ndenge elakisaka bokeseni ya statistiquement significatif entre ba traitements (p < 0.05).