Lelo *Adresse ya lelo: Cologne 50931, Allemagne, Bolukiluki ya Cluster ya Excellence ya Cologne na ntina ya eyano ya mpasi ya baselile na bokono oyo etali bobange (CECAD).
Dégénérescence neuronale ya ba maladi ya mitochondrie etalelami lokola oyo ekoki kobongwana te mpo plasticité métabolique ya ba neurones ezali moke, kasi effet ya dysfonctionnement mitochondriale na autonomie cellulaire ya métabolisme neuronale na nzoto eyebani malamu te. Awa, tozali kokotisa protéome spécifique cellulaire ya ba neurones ya Purkinje na déficience progressive ya OXPHOS oyo euti na dynamique ya fusion mitochondriale oyo ebebi. Tomoni ete dysfonctionnement mitochondriale e déclenché changement profond na domaine ya protéomique, oyo na suka ememaki na activation séquentielle ya ba programmes métaboliques précis avant liwa ya ba cellules. Na mbalakaka, tozwaki induction ya polele ya pyruvate carboxylase (PCx) mpe ba enzymes mosusu oyo ebundisaka bobange oyo ebakisaka ba intermédiaires ya cycle ya TCA. Inhibition ya PCx ebakisaki stress oxidatif mpe neurodégénérescence, elakisaki que atherosclérose ezali na effet protecteur na ba neurones oyo ezangi OXPHOS. Kozongisama ya fusion mitochondriale na ba neurones oyo ebebi na nsuka ezongisaka mpenza nsima bizaleli wana ya métabolisme, mpe na ndenge yango, epekisaka liwa ya baselile. Makambo oyo tomoni emonisi banzela oyo eyebani liboso te oyo epesaka bokasi ya koyika mpiko na dysfonctionnement ya mitochondrie mpe emonisi ete dégénérescence neuronale ekoki kozongisama nsima ata na ba étapes ya suka ya bokono.
Role central ya mitochondrie na kobatela métabolisme ya énergie neuronale ezali souligné na ba symptômes neurologiques ya monene oyo ezo sangana na ba maladies ya mitochondrie ya moto. Mingi ya ba maladi oyo ewutaka na ba mutations ya ba gènes oyo e régulaka expression ya gène mitochondrial (1, 2) to déstruction ya ba gènes oyo etali dynamique mitochondriale, oyo e affectaka indirectement stabilité ya ADN mitochondrial (ADNm) (3, 4). Mosala na ba modèles ya ba nyama elakisaki que na réponse na dysfonctionnement mitochondriale na ba tissus ya zinga zinga, ba voies métaboliques conservatrices (5-7) ekoki ko activer, oyo epesaka ba informations ya ntina pona compréhension ya profondeur ya pathogénèse ya ba maladies complexes oyo. Na bokeseni mpenza, bososoli na biso ya mbongwana ya métabolisme ya mitindo ya baselile ya sikisiki oyo euti na bozangi ya monene ya kobimisama ya adénosine triphosphate (ATP) ya mitochondriale ya bɔɔngɔ́ ezali na ntina mingi (8), oyo ezali kopesa ntina mingi na ntina ya koyeba mikano ya kosalisa oyo ekoki kosalelama mpo na kopekisa to kopekisa maladi. Kopekisa kobeba ya misisa ya bɔɔngɔ (9). Kozanga ya makambo ezali likambo oyo ete baselile ya misisa etalelami mingi ete ezali na bopeto ya métabolisme oyo ezali mpenza moke soki tokokanisi yango na mitindo ya baselile ya misisa oyo ezali zingazinga ( 10 ). Soki totali ete baselile yango ezali na mokumba monene mpo na kosala boyokani na bopesi ya ba métabolites na ba neurones mpo na kolendisa bopanzani ya synaptique mpe koyanola na ba conditions ya ba blessures mpe ya maladie, makoki ya ko adapter métabolisme ya ba cellules na ba conditions ya défi ya tissus ya cerveau ezali presque limité na ba cellules gliales (11-14). En plus, hétérogénéité cellulaire inhérente ya tissus ya cerveau epekisaka mingi études ya ba changements métaboliques oyo esalemaka na ba sous-groupes spécifiques ya ba neurones. Yango wana, eyebani mingi te na ntina na mbuma ya sikisiki ya baselile mpe ya métabolisme ya dysfonctionnement ya mitochondrie na ba neurones.
Pona ko comprendre ba conséquences métaboliques ya dysfonctionnement mitochondriale, to isolé ba neurones ya Purkinje (PNs) na ba étapes différentes ya neurodégénérescence oyo ewutaka na déstruction ya fusion ya membrane extérieure mitochondriale (Mfn2). Atako ba mutations ya Mfn2 na bato ezali na boyokani na lolenge moko ya neuropathie sensorielle motrice héritée oyo eyebani na kombo ya Charcot-Marie-Tooth type 2A ( 15 ), kobebisama ya Mfn2 na ndenge ya condition na ba souris ezali méthode ya dysfonctionnement ya induction ya oxydation (OXPHOS) oyo eyebani malamu. Ba sous-types neuronaux ndenge na ndenge (16-19) mpe phénotype neurodégénératif oyo euti na yango ezali accompagné na ba symptômes neurologiques progressifs, lokola troubles ya mouvement (18, 19) to ataxie cérébellaire (16). Na kosalelaka kosangisa ya protéomique quantitative (LFQ) sans étiquette, métabolomique, imagerie, mpe ba méthodes virologiques, tozali kolakisa que neurodégénérescence progressive e induire makasi pyruvate carboxylase (PCx) mpe ba facteurs misusu oyo ezo intervenir na artériosclérose ya ba PNs in vivo Expression ya ba enzymes. Mpo na ko vérifier pertinence ya constat oyo, to réguler spécifiquement régulation ya expression ya PCx na ba PNs déficientes na Mfn2, mpe tomoni que opération oyo e aggraver stress oxidatif mpe e accélérer neurodégénérescence, donc prouver que azoospermie epesaka liwa ya cellule adaptabilité métabolique. Expression makasi ya MFN2 ekoki kobikisa mobimba PN ya dégénérescence terminale na déficience makasi ya OXPHOS, consommation massive ya ADN mitochondrial, mpe apparemment réseau mitochondriale oyo ebukani, oyo ezo souligner lisusu que forme oyo ya neurodégénérescence ekoki kutu ko se rétablir na étape avancée ya maladie avant liwa ya cellule.
Pona ko visualiser ba mitochondries na ba PNs knockout ya Mfn2, tosalelaki souche ya soso oyo epesaka nzela na ba mitochondries dépendantes ya Cre e cibler expression ya proteine ​​fluorescent jaune (YFP) (mtYFP) (20) Cre mpe to vérifiaki morphologie mitochondriale in vivo. Tomoni ete kobebisama ya gène Mfn2 na ba PN ekosala ete réseau mitochondrial ekabwana mokemoke (Figure S1A), mpe mbongwana ya liboso ezwamaki na poso 3 ya mbula. Na bokeseni, bobebisi monene ya couche ya ba cellules PN, lokola emonisami na bobungisi ya immunocoloration ya Calbindin, ebandaki te kino na poso 12 ya mibu (Figure 1, A mpe B). Kozanga boyokani ya ntango kati na mbongwana ya liboso ya morphologie ya mitochondrie mpe ebandeli oyo emonanaka ya liwa ya ba neurones etindaki biso tóluka koyeba mbongwana ya métabolisme oyo ebandisami na dysfonctionnement ya mitochondrie liboso ya liwa ya baselile. Tosalaki stratégie oyo esalemi na triage cellulaire activé par fluorescence (FACS) mpo na ko isoler PN oyo e exprimaka YFP (YFP+) (Figure 1C), mpe na ba souris témoins (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), oyo na sima bakobenga CTRL (Figure S1B). Optimisation ya stratégie ya gating oyo esalemi na intensité relative ya signal YFP epesi biso nzela ya ko purifier nzoto ya YFP+ (YFPhigh) ya ba PNs à partir ya ba non-PNs (YFPneg) (Figure S1B) to ba fragments axon/dendritiques fluorescentes présumés (YFPlow; Figure S1D, gauche), confirmé na microscope confocale (Figure S1D, droite). Pona ko vérifier identité ya population classifiée, tosalaki proteomique LFQ et puis analyse ya composante principale, pe tomoni que séparation claire ezali entre ba cellules YFPhigh na YFPneg (Figure S1C). Ba cellules YFPhigh elakisaki enrichissement net ya ba marqueurs ya PNs oyo eyebani (c.a.d. Calb1, Pcp2, Grid2 na Itpr3) (21, 22), kasi enrichissement moko te ya ba protéines oyo e exprimer mingi na ba neurones to na ba types mosusu ya ba cellules (Figure 1D) ). Comparaison entre ba échantillons na ba cellules classifiées YFPhigh oyo ezuami na ba expériences indépendantes elakisaki coefficient ya corrélation> 0,9, elakisaki reproductibilité ya malamu entre ba réplicas biologiques (Figure S1E). Na bokuse, ba données oyo e validaki plan na biso ya isolement aigu mpe spécifique ya PN possible. Lokola système ya pilote L7-cre oyo esalelami e induire recombination ya mosaïque na semaine ya liboso sima ya kobota (23), tobandaki ko culling ba souris na CTRL mpe conditionnel (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Kosangisa ba neurones. Sima ya kosilisa recombination, babengaka yango Mfn2cKO na poso 4 ya mbula. Lokola point ya suka, toponaki 8 semaines ya âge tango couche ya PN ezalaki intacte malgré fragmentation mitochondriale évident (Figure 1B et Figure S1A). Na mobimba, to quantifiaki total ya ba protéines 3013, oyo soki 22% esalemaki na ba annotations ya MitoCarta 2.0 oyo esalemaki na protéome mitochondrial lokola mitochondrie (Figure 1E) (Figure 1E) (24). Analyse ya expression génétique différentielle oyo esalemaki na semaine 8 elakisaki que kaka 10,5% ya ba protéines nionso nde ezalaki na ba changements ya significatifs (Figure 1F na Figure S1F), kati na yango ba protéines 195 ezalaki régulées en bas mpe ba protéines 120 ezalaki régulées en haut (Figure 1F). Ezali na ntina koyeba ete “analyse ya banzela ya sika” ya ensemble ya ba données oyo ezali kolakisa ete ba gènes oyo e exprimer différentiellement ezali mingi mingi na ensemble restreint ya ba voies métaboliques spécifiques (Figure 1G). Interessant, atako downregulation ya ba voies liées na OXPHOS na signalisation ya calcium e confirmer induction ya dysfonctionnement mitochondriale na ba PNs déficientes na fusion, ba catégories misusu oyo ezo involver mingi mingi métabolisme ya ba acides aminés ezali significativement upregulated, oyo ezali en ligne na métabolisme oyo esalemaka na ba membranes mitochondriales Rewiring ezali constant. kozanga kosala mosala.
(A) Ba photos confocale représentantes ya ba sections cérébelles ya ba souris CTRL na Mfn2cKO oyo ezali kolakisa perte progressive ya ba PNs (calbindin, gris); ba noyaux e contrecouché na DAPI. (B) Quantification ya (A) (analyse ya variance na nzela moko, ***P<0.001; n = 4 à 6 cercles à partir ya ba souris misato). (C) Ndenge ya mosala ya komeka. (D) Bopanzani ya carte chaleur ya ba marqueurs spécifiques na Purkinje (likolo) mpe ba types mosusu ya ba cellules (kati). (E) Diagramme ya Venn oyo ezali kolakisa motango ya ba protéines mitochondriales oyo ezuami na PN oyo e classifié. (F) Graphique volcan ya ba protéines exprimées différentiellement na ba neurones Mfn2cKO na 8 semaines (valeur ya coupe ya signification ya 1,3). (G) Analyse ya nzela ya créativité ezali kolakisa ba voies mitano ya motuya mingi ya up-regulation (rouge) na down-regulation (bleu) na Mfn2cKO PN oyo e classifié lokola 8 semaines. Niveau moyen ya expression ya proteine ​​moko na moko oyo ezuami elakisami. Carte ya chaleur ya échelle gris: valeur P ajustée. ns, ezali na ntina te.
Ba données ya protéomique elakisaki que expression ya proteine ​​ya ba complexes I, III, na IV ekita mokemoke. Ba complexes I, III, mpe IV nionso ezalaki na ba sous-unités essentiels codés na ADNmt, alors que complexe II, oyo ezalaki kaka codé nucléaire, ezalaki essentiellement affecté te (Figure 2A et Figure S2A). . Na boyokani na ba résultats ya protéomique, immunohistochimie ya ba sections ya tissus cérébelaires elakisaki que niveau ya sous-unité ya MTCO1 (sous-unité 1 ya cytochrome C oxydase mitochondriale) ya complexe IV na PN ekiti mokemoke (Figure 2B). Sous-unité Mtatp8 codée na ADNmt ekitisama mingi (Figure S2A), alors que niveau ya état stationnaire ya sous-unité ya synthase ATP codée na nucléaire etikalaki ndenge moko te, oyo ezali na boyokani na complexe F1 ya sous-assemblage stable ya ATP synthase oyo eyebani tango expression ya mtDNA ezali stable. Formation ezali constante. Kokatakata (7). Evaluation ya niveau ya ADNmt na ba PNs Mfn2cKO classés na réaction en chaîne ya polymérase en temps réel (qPCR) e confirmaki ba diminution graduelle ya nombre ya copie ya ADNmt. Soki tokokanisi yango na groupe témoin, na poso 8 ya mbula, kaka soki 20% ya niveau ya ADNmt nde ekangamaki (Figure 2C). Na boyokani na ba résultats oyo, coloration microscopie confocale ya ba PNs Mfn2cKO esalemaki pona ko détecter ADN, elakisaka consommation dépendante ya temps ya ba nucléotides mitochondriaux (Figure 2D). Tomoni ete kaka ba candidats mosusu oyo esanganaka na dégradation ya proteine ​​mitochondriale mpe na réponse ya stress nde ezalaki régulées en hausse, na kati na yango Lonp1, Afg3l2 mpe Clpx, mpe ba facteurs ya assemblage complexe OXPHOS. Mbongwana ya monene te na niveau ya ba protéines oyo ezo intervenir na apoptose (Figure S2B). Ndenge moko mpe, tomonaki ete mitochondrie mpe ba canaux ya réticulum endoplasmique oyo ekɔtaka na transport ya calcium ezali kaka na mbongwana mikemike (Figure S2C). En plus, évaluation ya ba protéines liées na autophagie ezuaki ba changements ya significatif te, oyo ezali na boyokani na induction visible ya ba autophagosomes observés in vivo na immunohistochimie na microscopie électronique (Figure S3). Kasi, dysfonctionnement progressif ya OXPHOS na ba PNs ezali accompagné na ba changements mitochondriaux ultrastructurales ya polele. Ba clusters mitochondriaux ekoki komonana na nzoto ya ba cellules mpe na banzete ya dendritique ya ba PN ya Mfn2cKO ya mibu 5 mpe 8, mpe structure ya membrane ya kati esali mbongwana ya mozindo (Figure S4, A mpe B). Na boyokani na mbongwana wana ya ultrastructure mpe na bokiti ya monene ya ADNmt, analyse ya ba tranches cérébéles aiguës ya cerveau na ester méthyl tétraméthylrhodamine (TMRM) elakisaki ete potentiel ya membrane mitochondriale na ba PNs ya Mfn2cKO ekita makasi (Figure S4C).
(A) Analyse ya cours ya temps ya niveau ya expression ya complexe OXPHOS. Tala kaka ba proteines oyo ezali na P<0.05 na poso 8 (ANOVA à deux voies). Line pointillée: Ajustement moko te soki tokokanisi yango na CTRL. (B) Na lobɔkɔ ya mwasi: Ndakisa ya eteni ya bɔɔngɔ oyo batye bilembo na anticorps anti-MTCO1 (barre d’échelle, 20 μm). Etando oyo nzoto ya baselile ya Purkinje ezwi ezipami na langi ya jaune. Droite : Quantification ya niveau ya MTCO1 (analyse ya variance na nzela moko; n = 7 à 20 cellules analysées à partir ya ba souris misato). (C) Analyse qPCR ya nombre ya copie ya mtADN na PN oyo e classé (analyse ya variance à une voie; n = 3 à 7 souris). (D) Na lobɔkɔ ya mwasi: Ndakisa ya eteni ya bɔɔngɔ oyo batye bilembo na anticorps anti-ADN (barre d’échelle, 20 μm). Etando oyo nzoto ya baselile ya Purkinje ezwi ezipami na langi ya jaune. Droite: Quantification ya ba lésions ya ADNmt (analyse ya variance à une voie; n = 5 à 9 cellules à partir ya ba souris misato). (E) Ndakisa ya eteni ya cerveau aigu oyo ezali kolakisa ba cellules mitoYFP + Purkinje (fleche) na enregistrement ya pince ya patch ya cellule mobimba. (F) Quantification ya courbe IV. (G) Enregistrements représentants ya injection ya courant dépolarisation na ba cellules ya Purkinje CTRL na Mfn2cKO. Trace ya likolo: Pulse ya liboso oyo e déclenché AP. Trace ya se: Fréquence ya AP ya likolo. (H) Quantification ya ba entrées spontanées postsynaptiques (sPSPs). Trace ya enregistrement représentant na rapport ya zoom na yango elakisami na (I). Analyse ya variance na nzela moko e analysé n = 5 à 20 cellules à partir ya ba souris misato. Ba données elakisami lokola moyenne±SEM; *P<0,05 mpe; **P<0,01 ezali na kati; ***P<0,001 ezali na kati. (J) Ba traces représentantes ya AP spontané oyo e enregistrer en utilisant mode pince ya patch perforé. Trace ya likolo: Fréquence ya AP ya likolo. Trace ya se: zoom ya AP moko. (K) Kotanga motango ya fréquence moyenne pe maximale ya AP selon (J). Momekano ya Mann-Whitney; n = 5 cellules e analysé na ba souris minei. Ba données elakisami lokola moyenne±SEM; ya ntina te.
Bebisi ya polele ya OXPHOS emonanaki na Mfn2cKO PN ya poso 8, elakisaka ete mosala ya physiologique ya ba neurones ezali mpenza ya kozanga momesano. Na yango, to analyser ba caractéristiques électriques passives ya ba neurones déficientes na OXPHOS na 4 à 5 semaines mpe 7 à 8 semaines na kosala ba enregistrements ya pince ya patch cellulaire mobimba na ba tranches cérébelles aiguës (Figure 2E). Na mbalakaka, moyenne ya potentiel ya membrane ya repos mpe résistance ya entrée ya ba neurones Mfn2cKO ezalaki ndenge moko na contrôle, atako ezalaki na ba différences subtiles entre ba cellules ( Tableau 1 ). Ndenge moko mpe, na poso 4 kino 5 ya mibu, mbongwana ya monene te na boyokani ya courant-tension (courbe IV) (Figure 2F). Kasi, ata neurones moko te ya Mfn2cKO ya poso 7 kino 8 ebikaki na régime IV (etape ya hyperpolarisation), elakisaka ete ezali na sensibilité ya polele na potentiel ya hyperpolarisation na étape oyo ya suka. Na bokeseni, na ba neurones Mfn2cKO, ba courants dépolarisants oyo esalaka ba décharges ya potentiel d’action répétitive (AP) e tolérer malamu, elakisaka que ba modèles ya décharge na bango mobimba ekeseni mpenza te na oyo ya ba neurones témoins ya poso 8 ( Tableau 1 mpe Figure 2G ). Ndenge moko mpe, fréquence mpe amplitude ya ba courants postsynaptiques spontanées (sPSCs) ekokanaki na oyo ya groupe témoin, mpe fréquence ya ba événements emati kobanda na poso 4 kino poso 5 kino poso 7 kino poso 8 na bomati ya ndenge moko (Figure 2, H mpe I). Période ya maturation synaptique na ba PNs (25). Ba résultats ya ndenge moko ezuami sima ya ba patches ya PNs perforés. Configuration oyo epekisaka compensation possible ya ba défauts ya ATP cellulaire, ndenge ekoki kosalema na enregistrement ya pince ya patch cellulaire mobimba. Mingimingi, potentiel ya membrane ya bopemi mpe fréquence ya tir spontané ya ba neurones Mfn2cKO esimbamaki te (Figure 2, J mpe K). Na bokuse, ba résultats oyo ezali kolakisa que ba PNs oyo ezali na dysfonctionnement évident ya OXPHOS ekoki ko faire face na ba modèles ya décharge ya haute fréquence malamu, elakisaka que ezali na mécanisme ya compensation oyo e permettre bango ba maintenir ba réponses électrophysiologiques presque normales.
Ba données elakisami na moyenne ± SEM (analyse ya variance à une voie, test ya comparaison multiple ya Holm-Sidak; *P<0.05). Nimero ya unité elakisami na ba parenthèses.
Tobandaki koluka koyeba soki catégorie moko boye na ensemble ya ba données ya protéomique (Figure 1G) ezali na ba voies oyo ekoki ko contrer déficience makasi ya OXPHOS, na yango kolimbola pourquoi PN affecté ekoki ko maintenir électrophysiologie presque normale (Figure 2, E à K). . Analyse protéomique elakisaki que ba enzymes oyo ezo intervenir na catabolisme ya ba acides aminés à chaîne branchée (BCAA) ezalaki significativement régulées en haut (Figure 3A et Figure S5A), mpe produit final acétyl-CoA (CoA) to succinyl CoA ekoki ko supplémenter ba tricarboxylates na cycle ya Acide artériosclérose (TCA). Tomonaki ete motuya ya BCAA transaminase 1 (BCAT1) mpe BCAT2 nyonso mibale ekómaki mingi. Ba catalyser étape ya liboso ya catabolisme ya BCAA na ko produire glutamate na α-cétoglutarate ( 26 ). Ba sous-unités nionso oyo esali complexe ya déshydrogénase ya acide céto (BCKD) ya chaîne branchée (BCKD) ezali régulées en hausse (complexe e catalyser décarboxylation oyo elandi mpe oyo ekoki kobongwana te ya skeleton ya carbone BCAA oyo euti na yango) (Figure 3A mpe Figure S5A). Kasi, mbongwana ya polele te na BCAA yango moko ezwamaki na PN oyo ekabolamaki, oyo ekoki kozala mpo na bomati ya bozui ya baselile ya ba acides aminés wana ya ntina to bosaleli ya ba sources mosusu (glucose to acide lactique) mpo na kobakisa cycle ya TCA (Figure S5B). Ba PN oyo ezangi OXPHOS elakisaki pe bomati ya décomposition ya glutamine pe ba activités ya transamination na 8 semaines ya âge, oyo ekoki ko refleter na up-regulation ya ba enzymes mitochondriales glutaminase (GLS) na glutamine pyruvate transaminase 2 (GPT2) (Figure 3, A et C). Ezali na ntina koyeba ete up-regulation ya GLS ezali limité na isoforme spliced ​​glutaminase C (GLS-GAC) (change ya Mfn2cKO/CTRL ezali soki 4,5 fois, P = 0,05), mpe up-regulation na yango spécifique na ba tissus ya cancer Ekoki ko soutenir bioénergie mitochondriale. (27) (27).
(A) Carte ya molunge ezali kolakisa mbongwana ya pli na niveau ya proteine ​​mpo na nzela oyo elakisami na poso 8. (B) Ndakisa ya tranche ya cerveau oyo etiamaki elembo na anticorps anti-PCx (barre d’échelle, 20 μm). Flɛ́mɛ ya langi ya jaune ezali kolakisa nzoto ya baselile ya Purkinje. (C) Analyse ya expression ya proteine ​​ya cours ya temps oyo ezuami lokola candidat important pona atherosclérose (test t multiple, *FDR <5%; n = 3-5 souris). (D) Likolo : Schéma oyo ezali kolakisa banzela ndenge na ndenge ya kokota na carbone oyo ezali na bilembo oyo ezali na kati ya traceur ya [1-13C]pyruvate (elingi koloba, na nzela ya PDH to na nzela ya trans-artériel). Na nse: Etanda ya violon ezali kolakisa pourcentage ya carbone marqué unique (M1) oyo ebongwani na acide aspartique, acide citrique mpe acide malic sima ya ko marquer ba tranches ya cerveau aiguë na [1-13C]pyruvate (test t-paired; ** P <0.01). (E) Botalisi ya lisolo ya tango ya mobimba ya nzela oyo elakisami. Talá kaka baproteini oyo ezali na P<0.05 na pɔsɔ 8 . Line pointillée : valeur ya ajustement te (analyse ya variance à deux voies; * P <0.05; *** P <0.001). Ba données elakisami lokola moyenne±SEM.
Na analyse na biso, catabolisme ya BCAA ekomi moko ya ba voies clés ya up-regulation. Likambo oyo ezali kolakisa makasi ete volume ya ventilation oyo ekoti na cycle ya TCA ekoki ko changer na PN oyo ezangi OXPHOS. Yango ekoki komonisa lolenge monene ya cableage métabolique neuronale, oyo ekoki kozala na impact direct na physiologie neuronale mpe na kobika na tango ya maintien ya dysfonctionnement makasi ya OXPHOS. Na boyokani na hypothèse oyo, tomoni ete enzyme anti-atherosclérotique principale PCx ezali régulée en haut (Mfn2cKO/CTRL ebongwanaka soki mbala 1,5; Figure 3A), oyo e catalyser conversion ya pyruvate na oxaloacétate (28), oyo endimami ete ezali na tissus ya cerveau La expression in ezali restreint na ba astrocytes (29, 30). Na boyokani na ba résultats ya protéomique, microscopie confocale elakisaki que expression ya PCx emati spécifiquement mpe significativement na ba PNs déficientes na OXPHOS, alors que réactivité ya PCx ezalaki surtout restreint na ba cellules gliales ya Bergmann adjacentes ya témoin (Figure 3B). Pona ko tester fonctionnellement upregulation observée ya PCx, to traité ba tranches ya cerveau aiguë na tracer ya [1-13C]pyruvate. Tango pyruvate e oxydé na pyruvate déshydrogénase (PDH), étiquette isotope na yango elimwaki , Kasi ekotisami na ba intermédiaires ya cycle ya TCA tango pyruvate e métabolisé na ba réactions vasculaires (Figure 3D). Na soutien ya ba données na biso ya protéomique, to observaki nombre monene ya ba marqueurs oyo ewutaki na traceur oyo na acide aspartique ya ba tranches ya Mfn2cKO, alors que acide citrique na acide malic ezalaki pe na tendance moyenne, bien que significative te (Figure 3D).
Na ba neurones dopamine ya ba souris MitoPark oyo ezali na dysfonctionnement mitochondriale oyo euti na ba neurones dopamine oyo ebebisaka spécifiquement gène ya facteur de transcription mitochondrial A (Tfam) (Figure S6B), expression ya PCx ezalaki mpe significativement up-régulate (31), elakisaka que artériosclérose acide acétonique Occasion ya maladie ezali régulée na tango ya dysfonctionnement ya neuronale OXPHOS na nzoto. Ezali na ntina koyeba ete emonanaki ete ba enzymes unique (32-34) oyo ekoki kozala exprimé na ba neurones oyo ekoki kozala associée na artériosclérose ezali significativement up-régulées na ba PNs oyo ezangi OXPHOS, lokola propionyl-CoA carboxylase (PCC-A), Malonyl-CoA ebongoli propionyl-CoA na succinyl-CoA mpe enzyme malic mitochondriale 3 (ME3), . oyo mokumba na yango ya monene ezali ya kozongisa pyruvate na malate (Figure 3, A mpe C) (33, 35). En plus, tomoni bomati monene ya enzyme Pdk3, oyo e phosphoryler mpe bongo e inactiver PDH ( 36 ), alors que ba changements moko te emonanaki na enzyme Pdp1 oyo e activaka PDH to complexe enzymatique PDH yango moko (Figure 3A). Constamment, na ba PNs ya Mern2cKO, phosphorylation ya sous-unité α1 α (PDHE1α) sous-unité ya composante pyruvate déshydrogénase E1 ya complexe PDH na Ser293 (eyebani ko inhiber activité enzymatique ya PDH) ematisami ( Figure S6C) (Figure S6C). Pyruvate ezali na accès vasculaire te.
Na suka, tomonaki ete super voie ya biosynthèse ya sérine na glycine, cycle ya folate mitochondrial (1C) oyo etali yango mpe biosynthèse ya proline (Figure 1G mpe Figure S5C) nionso ezali significativement up-régulé, selon ba rapports, na tango ya processus ya activation. Ba tissus ya zinga zinga e activer na dysfonctionnement mitochondriale (5-7). Analyse confocale oyo e soutenir ba données oyo ya protéomique elakisaki que na PN oyo OXPHOS ezangi, ba tranches cérébelles ya ba souris ya 8 semaines e soumis na sérine hydroxyméthyltransférase 2 (SHMT2), enzyme clé ya cycle ya folate mitochondrial. Eyano ya monene ya bokasi ya nzoto (Figure S5D). Na 13 tranches cérébelles aiguës incubées na CU-glucose, ba expériences ya traçage métabolique e confirmaki lisusu up-regulation ya biosynthèse ya sérine na proline, elakisaki que flux ya ba isoformes ya carbone na sérine na proline emati (Figure S5E). Lokola ba réactions oyo GLS na GPT2 e promouvoir ezali responsable ya synthèse ya glutamate à partir ya glutamine mpe transamination entre glutamate na α-cétoglutarate, upregulation na bango elakisaka que ba neurones déficientes na OXPHOS ezali na demande augmentée ya glutamate , Yango ekoki kozala na but ya ko maintenir biosynthèse oyo emati ya proline (Figure S5C). Na bokeseni na mbongwana oyo, analyse protéomique ya ba astrocytes cérébelaires oyo ewutaki na ba souris Mfn2cKO spécifiques ya PN elakisaki que ba voies oyo (y compris ba antiperoxydases nionso) ebongwanaki mingi te na expression, elakisaki bongo Redirection métabolique oyo ezali sélective na PN dégradé (Fig. S6, D à G).
Na bokuse, ba analyses oyo emonisaki ba modèles significativement différents ya activation temporelle ya ba voies métaboliques spécifiques na ba PNs. Atako fonctionnement mitochondrial neuronale abnormal ekoki komema na atherosclérose ya liboso mpe remodelage 1C (Figure 3E mpe Figure S5C), mpe ata mbongwana oyo ekoki kokanisama na expression ya ba complexes I mpe IV, mbongwana na synthèse ya sérine de novo ezali kaka Emonanaki kaka na ba étapes ya suka. Dysfonctionnement ya OXPHOS (Figure 3E na Figure S5C). Ba résultats oyo e définir processus séquentiel oyo réponse mitochondriale (cycle 1C) na cytoplasmique (biosynthèse sérine) induit par stress synergiquement na augmentation ya atherosclérose na cycle ya TCA pona ko réshaper métabolisme neuronale.
Ba PN ya poso 8 oyo ezangi OXPHOS ekoki kobatela activité ya excitation ya fréquence ya likolo mpe kosala reconnexion métabolique ya monene mpo na ko compenser dysfonctionnement mitochondriale. Découverte oyo ebimisi possibilité moko intéressante que même na moment oyo, ba cellules oyo ekoki pe Ko Recevoir intervention thérapeutique pona ko retarder to ko prévenir neurodégénérescence. Retard. Tosilisaki likoki oyo na nzela ya ba interventions mibale ya lipanda. Na méthode ya liboso, to conçu vecteur ya virus associé adéno (AAV) dépendant ya Cre mpo MFN2 ekoki ko exprimer sélectivement na ba PNs déficientes na OXPHOS in vivo (Figure S7A). AAV oyo ezali ko coder MFN2 mpe gène reporteur fluorescent mCherry (Mfn2-AAV) e vérifié na ba cultures ya ba neurones primaires in vitro, oyo esalaki que MFN2 e exprimer na ndenge oyo e dépendant ya Cre mpe ebikisaki morphologie mitochondriale, na yango kopekisa neuromutation na ba neurones Mfn2cKO ( Figure S7, B, D et E). Na nsima, tosalaki ba expériences in vivo mpo na kopesa na ndenge ya stereotactique Mfn2-AAV ya poso 8 na cortex cerveau ya Mfn2cKO mpe ya ba souris témoins, mpe to analyser ba souris ya poso 12 (Figure 4A). Ba souris Mfn2cKO oyo bazwaki traitement bakufaki (Figure 1, A mpe B) (16). Transduction virale in vivo esali que expression sélective ya PN ezala na ba cercles cérébelaires mosusu (Figure S7, G et H). Injection ya AAV témoin oyo e exprimaka kaka mCherry (Ctrl-AAV) ezalaki na effet significatif te na degré ya neurodégénérescence na ba nyama ya Mfn2cKO. Na bokeseni, analyse ya ba Mfn2cKOs transduits na Mfn2-AAV elakisaki effet protecteur ya significatif ya couche cellulaire PN (Figure 4, B et C). Mingimingi, emonani ete densité ya ba neurones ezali pene na kokesenisa yango te na banyama oyo etalelaki yango (Figure 4, B mpe C, mpe Figure S7, H mpe I). Expression ya MFN1 kasi MFN2 te ezali également efficace na ko sauver liwa ya ba neurones (Figure 4C na Figure S7, C na F), oyo ezo lakisa que expression ya MFN1 éctopique ekoki ko suppléter efficacement manque ya MFN2. Analyse mosusu na niveau ya PN unique elakisaki que Mfn2-AAV ebikisaki mingi mingi ultrastructure ya mitochondrie, e normaliser niveau ya ADNmt, mpe e inverser expression ya likolo ya marqueur anti-angiogénèse PCx (Figure 4, C à E ). Inspection visuelle ya ba souris Mfn2cKO oyo babikisamaki na état ya repos elakisaki que posture na bango mpe ba symptômes moteurs (mouvement S1 à S3) ebongisamaki. Mpo na kosukisa, ba expériences oyo ezali kolakisa que reintroduction retardée ya MFN2 na ba PNs oyo ezangi makasi OXPHOS ekoki mpo na ko retourner consommation ya ADNmt mpe ko induire atherosclérose, na yango kopekisa dégénérescence ya axon mpe liwa ya ba neurones in vivo.
(A) Schéma oyo ezali kolakisa programme ya expérimentation mpo na ko injecter AAV oyo ezali ko coder MFN2 tango voie métabolique oyo elakisami e activé. (B) Ba images confocale représentantes ya ba tranches cérébelles ya 12 semaines transduits na 8 semaines na ba souris Mfn2cKO mpe marqués na anticorps anti-Calbindin. Na lobɔkɔ ya mobali: Kosala écaillement ya ba fibres axons. Échelle ya zoom ya axon ezali 450 na 75 μm. (C) Gauche: Quantification ya densité ya ba cellules ya Purkinje na boucle ya transduction ya AAV (AAV+) (analyse ya variance à une voie; n = 3 souris). Droite : analyse ya focus ya ADNmt na PN transduit na semaine 12 (test t non couplé; n = 6 cellules ya ba souris misato). * P <0,05 mpe; ** P <0,01. Ezali na ntina mingi. (D) Micrographies électroniques ya transmission représentant ya ba PN ya ba sections cérébelles Mfn2cKO transduites na ba vecteurs viraux indiqués. Masque rose ezali komonisa esika oyo ba dendrites ezwi, mpe carré ya jaune oyo ezali na ba points jaune ezali komonisa zoom oyo epesami na lobɔkɔ ya mobali; n ezali komonisa noyau. Barre ya échelle, 1μm. (E) ezali kolakisa ndakisa ya coloration PCx na PN transduit na 12 semaines. Barre ya échelle, 20μm. OE, koloba koleka ndelo; FC, mbongwana ya pli.
Na nsuka, tolukaki ntina ya kobika ya baselile oyo euti na peroxydase na ba PN oyo ekutanaki na dysfonctionnement ya OXPHOS. Tosalaki mCherry oyo ezali ko coder AAV-shRNA (ARN ya épingle ya suki ya mokuse) oyo ezali ko cibler spécifiquement mRNA ya PCx ya soso (AAV-shPCx), mpe to injectaki virus to contrôle na yango ya scrambled (AAV-scr) na cerveau ya ba souris Mfn2cKO. Injection esalemaki na poso ya minei ya âge (Figure 5A) mpo na kozua knockdown ya PCx efficace na période oyo expression ya PCx emati (Figure 3C) mpe couche ya cellule PN ezalaki kaka intacte (Figure 1A). Ezali na ntina koyeba ete kokweisa PCx (Figure S8A) ememaka na accélération ya monene ya liwa ya PN, oyo ekangami na bague infectée (Figure 5, B mpe C). Pona ko comprendre mécanisme ya ba effets métaboliques induits par PCx ​​up-regulation, to étudier état redox ya ba PNs après knockdown ya PCx na biosensor optique Grx1-roGFP2 médié par AAV e exprimé en même temps (Figure S8, B à D) pona ko évaluer glutathione Changement relative ya potentiel ya redox ya peptide (38). Na sima, tosalaki microscopie ya imagerie ya vie fluorescence à deux photons (FLIM) na ba tranches ya cerveau aiguë ya ba littermates ya Mfn2cKO ya poso 7 to ya contrôle mpo na ko détecter ba changements potentiels na état ya redox cytoplasmique sima ya ko vérifier ba conditions ya FLIM (Figure S8, E à G). Analyse elakisaki augmentation significative ya état ya oxydation ya PNs Mfn2cKO moko oyo ezangi expression ya PCx, oyo ekeseni na ba neurones témoins to ba PNs Mfn2cKO oyo e exprimaka kaka shRNA scrambled (Figure 5, D et E). Tango expression ya PCx ezalaki régulée en bas, pourcentage ya ba PNs ya Mfn2cKO oyo elakisaki état très oxydé emati na plus de trois fois (Figure 5E), elakisaka que régulation en haut ya PCx e maintenir capacité redox ya ba neurones dégénérées.
(A) Schéma oyo ezali kolakisa programme ya expérimentation mpo na ko injecter AAV oyo ezali ko coder shPCx tango voie métabolique oyo elakisami e activé. (B) Ba photos confocale représentantes ya ba sections cérébelles ya 8 semaines na ba souris Mfn2cKO transduits mpe marquées na anticorps anti-calcineurine na 4 semaines. Barre ya échelle, 450μm. (C) Quantification ya densité cellulaire ya Purkinje na ba boucles transduites na AAV (analyse ya variance à une voie; n = 3 à 4 souris). Ba données elakisami lokola moyenne±SEM; ***P<0,001 ezali na kati. (D) Elilingi ya FLIM ya momonisi ezali kolakisa moyenne ya bomoi ya PN ya poso 7 oyo ezali kobimisa capteur redox ya glutathione Grx1-roGFP2 na ba conditions ya expérimentale oyo elakisami. Ratio LUT (tableau ya kotala) : intervalle ya temps ya kobika (na picosecondes). Barre ya échelle, 25μm. (E) Histogramme ezali kolakisa bopanzani ya ba valeurs ya bomoi ya Grx1-roGFP2 kobanda na (D) (n=158 kino 368 cellules na ba souris mibale na condition moko na moko). Diagramme circulaire likolo ya histogramme moko na moko : ezali kolakisa motango ya ba cellules oyo ezali na ba valeurs ya vie molayi mingi (rouge, oxydé) to mokuse (bleu, réduit), oyo eleki 1 SD ya valeur moyenne ya vie na CTRL-AAV-scr. (F) Modèle oyo esengami ezali kolakisa effet protecteur ya upregulation ya PCx neuronale.
Na nyonso, ba données oyo tozali kopesa awa ezali kolakisa que re-expression ya MFN2 ekoki kobikisa mobimba PN avancé na déficience makasi ya OXPHOS, dépletion makasi ya ADNmt, mpe morphologie très abnormale lokola ista, na yango kopesa progrès continu ata na ba maladies avancées. Neurodégénérescence epesaka bilembeteli oyo ekoki kobongwana ya eteni oyo esalemaki liboso ya liwa ya baselile. Degré oyo ya flexibilité métabolique ezali lisusu souligné na makoki ya ba neurones ya ko induire atherosclérose (cablement ya cycle ya TCA), oyo e inhiber expression ya PCx na ba PNs oyo ezangi OXPHOS mpe ematisaka liwa ya ba cellules, na yango e jouaka rôle ya protection (Figure 5F).
Na études oyo, topesaki ba preuves que réponse ya ba PNs na dysfonctionnement ya OXPHOS ezali ya ko converger malembe malembe na atherosclérose ya cycle TCA na nzela ya voie d’activation différentielle activée na ba programmes métaboliques. To confirmaki analyse protéomique na ba méthodes complémentaires ebele mpe tomonisaki que tango to défier na dysfonctionnement mitochondriale makasi, ba neurones ezalaka na forme ya élasticité métabolique oyo eyebanaki liboso te. Na kokamwa na biso, processus mobimba ya câblage e marquer forcément te état métabolique terminal oyo ezo accompagner neurodégénérescence malembe malembe mpe irreversible, kasi ba données na biso ezo lakisa que ekoki ko constituer neuron ya entretien même na étape avant liwa ya cellule Mecanisme ya compensation fonctionnelle. Bomonisi oyo emonisi ete ba neurones ezali na degré monene ya plasticité métabolique na nzoto. Likambo oyo emonisi ete kozongisama ya MFN2 na nsima ekoki kozongisa nsima expression ya ba marqueurs métaboliques clés mpe kopekisa dégénérescence ya PN. Au contraire, epekisaka atherosclérose mpe esalaka que ba nerfs ekende mbangu. transsexual.
Moko ya makambo oyo ezali kobenda likebi mingi na bolukiluki na biso ezali ete ba PN oyo ezangi OXPHOS ekoki kobongisa métabolisme ya cycle ya TCA na ndenge ematisaka ba enzymes oyo elamusaka mpenza maladi ya artériosclérose. Réarrangement métabolique ezali likambo oyo emonanaka mingi na ba cellules ya cancer, misusu na yango etie motema na glutamine mpo na ko suppléter ba intermédiaires ya cycle TCA mpo na kobimisa ba équivalents réducteurs, oyo e diriger chaîne respiratoire mpe e maintenir production ya ba précurseurs ya biosynthèse ya lipide mpe nucléotidiques (39 , 40). Boyekoli moko oyo euti kosalema kala mingi te emonisaki ete na ba tissus périphériques oyo ezali kokutana na dysfonctionnement ya OXPHOS, reconnexion ya métabolisme ya glutamine/glutamate ezali mpe likambo ya monene ( 5 , 41 ), esika direction ya entrée ya glutamine na cycle ya TCA etali Pona gravité ya blessure ya OXPHOS ( 41 ). ). Kasi, ezali na bozangi ya bilembeteli ya polele na bokokani nyonso ya plasticité métabolique neuronale na nzoto mpe boyokani na yango oyo ekoki kozala na contexte ya bokono. Na boyekoli moko oyo euti kosalema na in vitro, ba neurones corticales primaires emonisami ete e mobiliser ba piscines ya glutamate mpo na neurotransmission, na yango elendisaka métabolisme oxidatif mpe atherosclérose na ba conditions ya stress métabolique ( 42 ). Ezali na ntina koyeba ete na nse ya inhibition pharmacologique ya enzyme ya cycle TCA succinate déshydrogénase, carboxylation ya pyruvate endimami ete ebatelaka synthèse ya oxaloacétate na ba neurones ya granule cérébellaire cultivée ( 34 ). Kasi, boyokani ya physiologique ya ba mécanismes oyo na tissus ya cerveau (esika bakanisaka ete atherosclérose ekangamaka mingi mingi na ba astrocytes) ezali naino na signification physiologique ya ntina (43). Na cas oyo, ba données na biso ezo lakisa que ba PNs oyo ebebisami na OXPHOS na nzoto ekoki ko changer na dégradation ya BCAA na carboxylation pyruvate, oyo ezali deux sources principales ya supplémentation ya ba intermédiaires ya piscine TCA. Atako contribution présumée ya catabolisme ya BCAA na métabolisme ya énergie neuronale e proposer, en plus ya rôle ya glutamate na GABA pona neurotransmission ( 44 ), ezali nanu na preuve moko te pona ba mécanismes oyo in vivo. Na yango, ezali pete kokanisa ete ba PN oyo ezali kosala malamu te ekoki ko compenser automatiquement consommation ya ba intermédiaires TCA oyo etambwisami na processus ya assimilation na komatisaka atherosclérose. Mingimingi, upregulation ya PCx ekoki kozala na ntina mpo na kobatela bosenga oyo ebakisami ya acide aspartique, oyo epesami likanisi na baselile oyo ezali kokola na dysfonctionnement mitochondriale ( 45 ). Kasi, analyse métabolomique na biso emonisaki te ba changements ya significatifs na niveau ya état stationnaire ya acide aspartitique na ba PNs Mfn2cKO (Figure S6A), oyo presumablement ezo refleter utilisation métabolique différente ya acide aspartitique entre ba cellules proliférantes na ba neurones post-mitotiques . Atako mécanisme exact ya upregulation ya PCx na ba neurones dysfonctionnelles in vivo etikali ko caractériser, to lakisaki que réponse oyo ya prématuré ezali na rôle important na maintien ya état redox ya ba neurones, oyo elakisami na ba expériences ya FLIM na ba tranches cérébelles. Mingimingi, kopekisa ba PN ematisaka PCx ekoki komema na état oxydé mingi mpe kosala ete baselile liwa nokinoki. Activation ya dégradation ya BCAA mpe carboxylation ya pyruvate ezali te ba façons ya ko caractériser ba tissus périphériques ya dysfonctionnement mitochondrial (7). Yango wana, emonani ete ezali likambo ya libosoliboso ya ba neurones oyo ezangi OXPHOS, ata soki ezali eloko kaka moko te, oyo ezali na ntina mpo na kobeba ya misisa ya bɔɔngɔ. .
Maladi ya cerveau ezali lolenge ya bokono ya neurodégénératif hétérogène oyo mbala mingi emonanaka lokola ataxie mpe mbala mingi ebebisaka ba PN ( 46 ). Population oyo ya ba neurones ezali surtout vulnérables na dysfonctionnement mitochondriale mpo dégénérescence sélective na bango na ba souris ekoki mpo na ko reproduire mingi ya ba symptômes moteurs oyo ezali caractériser ataxie spinocérébellaire ya moto ( 16 , 47 , 48 ). Engebene na balapolo, modèle ya soso transgénique na gène mutant ezali na boyokani na ataxie spinocérébellaire ya moto mpe ezali na dysfonctionnement mitochondriale ( 49 , 50 ), ko souligner importance ya koyekola ba conséquences ya déficience ya OXPHOS na PNPH. Yango wana, ebongi mpenza mpo na kokabola malamu mpe koyekola population wana ya ba neurones oyo ekeseni na mosusu nyonso. Kasi, soki totali ete ba PN ezali très sensibles na pression mpe ezali na proportion ya moke ya population mobimba ya ba cellules cérébelles, mpo na ba études mingi oyo esalemi na ba omics, kokabola yango na ndenge ya kopona lokola ba cellules mobimba ezali kaka likambo ya mpasi. Atako ezali presque impossible ya kozua manque absolu ya contamination ya ba types cellulaires misusu (surtout ba tissus adultes), tosangisaki étape ya dissociation efficace na FACS pona kozua nombre suffisant ya ba neurones viable pona analyse ya protéomique en aval, pe kozala na couverture ya proteine ​​Assez élevé (pene na 3000 protéines) par rapport na ensemble ya ba données existantes ya cérébelle mobimba (51). Na kobatelaka viability ya ba cellules entières, méthode oyo tozali kopesa awa epesi biso nzela kaka te ya ko vérifier ba changements na ba voies métaboliques na ba mitochondries, kasi pe ko vérifier ba changements na ba homologues cytoplasmiques na yango, oyo e compléter usage ya ba étiquettes ya membrane mitochondriale pona ko enrichir type cellulaire Méthode ya sika pona nombre ya mitochondrie na ba tissus complexes (52, 53). Méthode oyo tozali kolimbola ezali kaka te na boyokani na boyekoli ya baselile ya Purkinje, kasi ekoki kosalelama na pete na lolenge nyonso ya baselile mpo na kosilisa mbongwana ya métabolisme na bɔɔngɔ́ oyo ezali na maladi, bakisa mpe ba modèles mosusu ya dysfonctionnement mitochondriale.
Na nsuka, tomoni fenêtre thérapeutique na boumeli ya processus oyo ya réarrangement métabolique oyo ekoki kozongisa sima mobimba bilembo ya ntina ya stress cellulaire mpe kopekisa dégénérescence neuronale. Na yango, kososola ba implications fonctionnelles ya câblage oyo elimbolami awa ekoki kopesa ba insights fondamentales na ba traitements possibles pona ko maintenir viability neuronale na tango ya dysfonctionnement ya mitochondrie. Bolukiluki oyo ekosalema na mikolo ezali koya oyo ezali na mokano ya kokata mbongwana oyo esalemaka na métabolisme ya nguya na mitindo mosusu ya baselile ya bɔɔngɔ esengeli mpo na komonisa mpenza ndenge oyo etinda yango ekoki kosalelama na bamaladi mosusu ya misisa ya bɔɔngɔ.
Ba souris MitoPark esili kolimbolama liboso ( 31 ). Ba souris C57BL/6N oyo ezali na ba gènes ya loxP flanking Mfn2 elobamaki liboso ( 18 ) mpe ekatisamaki na ba souris L7-Cre ( 23 ). Na nsima, bakatisamaki na ba progénies hétérozygotes doubles oyo ezwamaki na ba souris Mfn2loxP/Mfn2loxP homozygotes mpo na kobimisa ba knockouts ya ba gènes spécifiques ya Purkinje mpo na Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Na sous-ensemble ya mating, allele SorStop-mito-YFP Gt (ROSA26) (stop-mtYFP) ekotisama na nzela ya ba croisements ya kobakisa ( 20 ). Ba procédures nionso ya nyama esalemaki engebene na malako ya Europe, ya ekolo mpe ya institution mpe endimami na LandesamtfürNatur ya Umwelt mpe Verbraucherschutz, Rhin du Nord-Westphalie, Allemagne. Mosala ya banyama elandaka mpe litambwisi ya Fédération européenne ya ba Associations ya sciences animales ya laboratoire.
Nsima ya ko anesthésie na dislocation ya cervix ya mwasi ya zemi, ba isoler embryon ya soso (E13). Ba dissectaki cortex na Solution ya mungwa équilibrée ya Hanks (HBSS) oyo ebakisami na Hepes ya 10 mM mpe elekaki na Moyenne d’Aigle Modified ya Dulbecco oyo ezalaki na papaïne (20 U/ml) mpe cystéine (1μg/ml). Incuber tissus na DMEM) mpe ko dissocier yango na digestion enzymatique. Ml) na 37°C na boumeli ya miniti 20, mpe na nsima esalemi na masini na DMEM oyo ebakisami na sérum bovin ya fœtus 10%. Ba cellules e semer na ba couvercles ya verre oyo elatisami na polylysine na densité ya 2×106 na saani ya culture ya 6 cm to na densité ya 0,5×105 cellules/cm2 pona analyse ya imagerie. Sima ya 4 heures, ba remplacer milieu na milieu sans sérum Neurobasal oyo ezalaki na 1% ya supplément B27 na 0,5 mM ya GlutaMax. Na sima ba neurones ebatelamaki na 37°C mpe 5% ya CO2 na boumeli ya expérience mobimba, mpe baleisamaki mbala moko na poso. Pona ko induire recombination in vitro, 3μl (plaque ya culture ya 24 puits) to 0,5μl (plaque ya 24 puits) ya vecteur ya virus AAV9 oyo elandi esalelamaki pona ko traité ba neurones na mokolo ya mibale in vitro : AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, nimero ya catalogue 105530-AAV9) mpe AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, nimero ya catalogue 105545-AAV9).
ADN complémentaire ya Mfn1 mpe Mfn2 ya soso (ezwami na plasmide Addgene #23212 mpe #23213, respectivement) ezali marqué na séquence V5 (GKPIPNPLLGLDST) na C-terminus, mpe e fusionné na mCherry na cadre na nzela ya séquence T2A. Grx1-roGFP2 ezali likabo ya Heidelberg T. P. Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Na ko remplacer cassette tdTomato na nzela ya ba méthodes ya clonage conventionnelle, cassette e subcloné na mokuwa ya mokɔngɔ ya pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (Numéro de référence ya Addgene 28306) mpo na kobimisa pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG- FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 mpe Ba vecteurs ya pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Stratégie ya ndenge moko esalemaki mpo na kobimisa vecteur témoin pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Pona kosala construction AAV-shPCx, esengeli vecteur AAV ya plasmide (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) oyo ezali na séquence ya ADN oyo ezali ko coder shRNA oyo ezali ko cibler PCx ​​ya soso (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) Na nse ya bokonzi ya promoteur U6, mCherry esalelamaka na nse ya bokonzi ya promoteur ya CMV. Bokeli ya ba vecteurs auxiliaires ya AAV esalemaki engebene na malako ya mosali (Cell Biolabs). Na mokuse, salelá plasmide ya transfert oyo ememaka mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) na boumeli ya mwa ntango Transfection ya ba cellules 293AAV-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) to Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) gène codage, mpe lisusu codage ya proteine ​​capside AAV1 mpe proteine ​​accessoire Plasmide plasmide emballage, na kosalelaka méthode ya phosphate de calcium. Supernatant ya virus brut ezuami na ba cycles ya congelation-dégel na bain ya glace/éthanol ya sec mpe ba cellules lysées na saline tamponée na phosphate (PBS). Vecteur ya AAV e purifié na ultracentrifugation discontinue ya gradient iodixanol (24 heures na 32.000 rpm na 4°C) mpe e concentré na nzela ya filtre centrifugal Amicon ultra-15. Titre ya génome ya AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×1013 copie génome (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG- FLEX ezalaki ndenge elobamaki liboso (54), emesamaki na PCR quantitative en temps réel (qPCR) -MFN1-V5 (1,9×1013 GC/ml) mpe AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×1012 GC/ml).
Ba neurones primaires e gratter na 1x PBS ya malili ya glace, e pelleté, mpe sima e homogénéisé na 0,5% Triton X-100 / 0,5% ya désoxycholate de sodium/PBS lyse tampon oyo ezalaki na phosphatase na inhibiteur ya protease (Roche). Quantification ya proteine ​​esalemaki na nzela ya test ya acide bicinchoninique (Thermo Fisher Scientific). Na nsima, bakabolaki baproteini yango na nzela ya électrophorèse na gel SDS-polyacrylamide, mpe na nsima balongolaki yango na membrane ya fluorure ya polyvinylidene (GE Healthcare). Bokanga bisika oyo ezali spécifique te pe bo incuber na anticorps primaire (tala Tableau S1 pona ba détails) na miliki 5% na TBST (saline tamponée na Tris na Tween), ba étapes ya kosukola pe anticorps secondaire na TBST Incubate. Incuber na anticorps primaire butu mobimba na +4°C. Sima ya kosukola, pakola anticorps secondaire na boumeli ya ngonga 2 na température ambiante. Na sima, na ko incuber blot moko na anticorps anti-β-actine, chargement moko e confirmer. Détection na ko convertir na chimiluminescence pe ko améliorer chimiluminescence (GE Healthcare).
Ba neurones oyo elonamaki liboso na ba couvercles ya verre ekangamaki na 4% ya paraformaldehyde (PFA)/PBS na point de temps oyo epesamaki na température ambiante na boumeli ya miniti 10. Ba permée ya liboso na ba laps de couvercle na 0,1% ya Triton X-100/PBS na boumeli ya miniti 5 na température ambiante, mpe na sima na tampon bloquant [3% albumine sérum bovine (BSA)/PBS]. Na mokolo ya mibale, ba sukolaki ba couvercles na tampon bloquant mpe ba incuber na anticorps secondaire conjugué na fluorophore oyo ebongi na boumeli ya ngonga 2 na température ambiante; na nsuka, ba échantillons esukolamaki malamu na PBS na 4′,6-diamidino-2 -Phenylindole (DAPI) ezali contrecolor mpe na sima ekangami na lamina ya microscope na Aqua-Poly/Mount.
Ba souris (ya mibali mpe ya mwasi) ba anesthésie na injection intrapéritonéale ya ketamine (130 mg/kg) mpe xylazine (10 mg/kg) mpe bapesaki bango sous-cutané na carprofène analgésiques (5 mg/kg) , Mpe batiaki yango na instrument stéréotactique (Kopf) équipé na pad ya molunge. Exposer crâne mpe salela perceuse dentaire mpo na ko mince eteni ya cortex cérébellaire oyo ekokani na mokuwa ya mis (kobanda na lambda : mokila 1,8, latérale 1, oyo ekokani na ba lobules IV mpe V). Salelá ntonga ya seringue oyo ebaluki mpo na kosala na likebi mpenza libulu moke na mokuwa ya motó mpo na koboya kobebisa misisa oyo ezali na nse. Na nsima, batyaka malɛmbɛmalɛmbɛ capillaire ya verre oyo ebendami mikemike na kati ya libulu ya micro (kobanda na -1,3 tii -1 na ngámbo ya ventral ya dura mater), mpe ba injectaka 200 kino 300 nl ya AAV na micro-injecteur (Narishige) na ba seringues manuelles (Narishige) mbala mingi na pression moke na boumeli ya eleko ya fenêtre ya miniti 10 kino 20. Sima ya infusion, tia capillaire pendant 10 minutes mosusu po virus epalangana mobimba. Nsima ya kobimisa ba capillaires, bakangaka loposo na bokebi mpo mpota evimba mingi te mpe nyama yango abika. Banyama yango ezwaki lisalisi ya nkisi oyo ekitisaka mpasi (caspofène) na boumeli ya mikolo mingi nsima ya lipaso, na boumeli ya ntango yango, balandaki malamu ezalela ya nzoto na bango mpe na nsima babomaki bango na ntango oyo balobaki. Ba procédures nionso esalemaki engebene na ba guidelines ya Europe, nationale mpe institutionnelle mpe endimami na LandesamtfürNatur ya Umwelt mpe Verbraucherschutz, Rhénanie du Nord-Westphalie, Allemagne.
Ba anesthésie ya banyama na ketamine (100 mg/kg) mpe xylazine (10 mg/kg), mpe motema e perfusé liboso na 0,1 M PBS, mpe na sima na 4% PFA na PBS. Ba dissectaki tissus mpe ba fixer yango na 4% PFA/PBS butu mobimba na 4°C. Basalelaki mbeli oyo ezali koningana (Leica Microsystems GmbH, Vienne, Autriche) mpo na kobongisa biteni ya sagittale (ya bonene ya 50 μm) oyo euti na bɔɔngɔ oyo ekangamaki na PBS. Soki elobami te, bazalaki kosala tache ya biteni oyo ezali kopumbwa na bonsomi ndenge tolobeli yango awa na likoló (13) na température ya ndako mpe na koningana. Na mokuse, liboso, ba tranches oyo ezuami e perméabiliser na 0,5% Triton X-100/PBS na boumeli ya 15 minutes na température ambiante; mpo na ba épitopes mosusu (Pcx mpe Shmt2), na na tampon tris-EDTA na 80°C (PH 9) chauffer ba tranches na boumeli ya 25 minutes na esika ya étape oyo. Na nsima, biteni yango ekɔtisamaki na anticorps primaire (tala Tableau S1) na tampon bloquant (3% BSA/PBS) na 4°C butu mobimba na koningana. Mokolo oyo elandaki, basukolaki biteni yango na tampon bloquant mpe ba incuber yango na anticorps secondaire conjugué na fluorophore oyo ebongi na boumeli ya ngonga 2 na température ambiante; na nsuka, biteni yango esukolamaki malamu na PBS, ekɔtisamaki na DAPI, mpe na nsima ekangamaki na AquaPolymount Na diapositive ya microscope.
Microscope confocal scanner laser (TCS SP8-X to TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) oyo ezalaki na laser ya lumière blanche mpe laser ultraviolet ya 405 diodes esalelamaki mpo na kosala image ya échantillon. Na ko exciter fluorophore pe kosangisa signal na Détecteur Hybride (HyDs), logiciel LAS-X esalelamaki pona kosangisa ba images empilées oyo ezo correspondre na échantillonnage ya Nyquist na mode séquentiel : pona ba panneaux non quantitatifs, ezali ba signaux très dynamiques (par exemple, na ba cellules somatiques pe ba dendrites) mtYFP) Salelá HyD pona ko détecter nombre ya ba PNs na mode BrightR). Gating kobanda 0,3 kino 6 ns esalemi mpo na kokitisa fond.
Kozwa bililingi na ntango ya solosolo ya baselile oyo ekabolami na molɔngɔ. Sima ya kosala triage na milieu Neurobasal-A oyo ezali na 1% ya supplément B27 mpe 0,5 mM ya GlutaMax, ba cellules e semer mbala moko na ba lames ya verre revête poly-l-lysine (μ-Slide8 Well, Ibidi, numéro ya catalogue 80826) , Mpe na sima babomba yango na 37°C mpe 5% ya CO2 na heure 1 mpo na ko permettre ba cellules e se installer. Imagerie en temps réel esalemaki na microscope confocal ya scanner laser Leica SP8 oyo ezali na objectif objectif ya mafuta ya laser ya pembe, HyD, 63×[1.4 ouverture numérique (NA)] mpe na étape ya chauffage.
Ba anesthésie ya soso noki na gaz carbonique mpe bakataki ye motó, balongolaki bɔɔngɔ nokinoki na mokuwa ya motó, mpe bakataki yango na épaisseur ya 200μm (mpo na expérience ya étiquetage 13C) to 275μm ya épaisseur (mpo na ba expériences mibale ya photon) section sagittale etondisamaki na biloko oyo elandi The glace (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Allemagne) etondi na biloko oyo : 125 mM ya malili ya glace, ya carbone (95% O2 mpe 5% CO2) ya Ca2 + moke + fluide cérébrospinal artificiel (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM ya tampon phosphate de sodium, 25 mM NaHCO3, 25 mM ya glucose, 0,5 mM CaCl2 mpe 3,5 mM MgCl2 (pression osmotique ya 310 kino 330 mmol). Botindika ba tranches ya cerveau oyo ezuami na chambre avant incubation oyo ezali na Ca2 + ACSF ya likolo (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampon phosphate de sodium, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucose, 1,0 mM CaCl2 mpe 2,0 mM MgCl2) Moyen) pH 7,4 mpe 310 kino 320 mmol).
Na boumeli ya mosala ya kozwa bililingi, bamemaki biteni yango na ndako oyo ebongisamaki mpo na kozwa bililingi, mpe komeka yango esalemaki na nse ya perfusion ya ACSF oyo ezalaki kolandana na molunge oyo ezali ntango nyonso ya 32° tii 33°C. Microscope ya scanner laser multiphoton (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) oyo ezali na objectif objectif Leica 25x (NA 0.95, mayi), laser Ti: Sapphire (Chameleon Vision II, Coherent) esalelamaki mpo na kozwa bilili ya biteni. Module ya FLIM (PicoHarp300, PicoQuant) oyo ezali na kati.
FLIM ya Grx1-roGFP2. Mbongwana ya état redox cytoplasmique ya ba PNs emekamaki na FLIM ya ba photons mibale na ba tranches ya cerveau sagittale, esika biosensor Grx1-roGFP2 etali ba PNs. Na couche ya PN, champ ya acquisition eponami soki 50 à 80 μm na se ya surface ya tranche mpo na ko assurer que ezala na PN viable (elingi koloba, manque ya structure perlée to ba changements morphologiques neuronaux pembeni ya ba dendrites) mpe capteur roGFP2 double positif mpe AAV codage shRNA PCx to séquence ya contrôle na yango (chaque co-expressant mCherry). Sangisa bilili ya ebele moko na zoom numérique 2x [longi d’onde ya excitation: 890 nm; 512 nm 512 ba pixels]. Détection : HyD interne, groupe ya filtre isothiocyanate fluorescéine (FITC)] mpe moyenne ya image na kati ya 2 à 3 minutes esalelami mpo na kosala ete ba photons ekoki esangisi (1000 photons na mobimba) mpo na fitting ya courbe. Sensibilité ya sonde Grx1-roGFP2 mpe vérification ya ba conditions ya FLIM esalemaki na ko suivre valeur ya durée de vie ya roGFP2 tango ebakisaki 10 mM H2O2 exogène na ACSF ya perfusion (po na ko maximiser oxydation, esali que durée ya vie emata), mpe sima kobakisa 2 mM dithiothreitol (ekitisaka degré ya réduction, esali que ekiti na boumeli ya bomoi) (Figure S8, D kino G). Salelá logiciel FLIMfit 5.1.1 mpo na kosala analize ya ba résultats oyo ozwi, kokotisa courbe ya détérioration exponentielle unique ya image mobimba na IRF oyo emesami (fonction ya réponse ya instrument), mpe χ2 ezali soki 1. Mpo na kosala calcul ya vie ya PN moko, masque oyo ezali zinga zinga ya nzoto ya misisa esalemaki na maboko, mpe moyenne ya vie na masque moko na moko esalemaki mpo na quantification.
Analyse ya potentiel mitochondriale. Sima ya ko incuber section aiguë na TMRM ya 100 nM oyo ebakisami directement na ACSF perfusé pendant 30 minutes, ba changements ya potentiel mitochondrial ya ba PNs emekamaki na microscope ya deux photons. Imagerie TMRM esalemaki na ko exciter sonde na 920 nm mpe kosalela HyD interne (tétraméthylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) mpo na kosangisa ba signaux; na kosalelaka longueur d’onde ya excitation moko kasi na kosalelaka HyD interne ekeseni (FITC :525/50) mpo na image mtYFP. Salelá plug-in ya ImageJ ya Image Calculator mpo na kotalela makoki ya mitochondriale na nivo ya baselile moko. Na mokuse, équation plug-in : signal = min (mtYFP, TMRM) esalelamaka pona koyeba région mitochondriale oyo elakisaka signal ya TMRM na Purkinje Somali na image confocale ya pile unique ya canal correspondant. Na sima e quantifier zone ya pixel na masque oyo ezuami, et puis e normaliser na image ya seuil correspondante ya pile unique ya canal mtYFP pona kozua fraction mitochondriale oyo ezali kolakisa potentiel mitochondrial.
Elilingi yango elongolamaki na logiciel Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Pona ba photos scannées ya ba carreaux, montage ya carreaux moko esalemaka na nzela ya algorithme ya couture automatique oyo epesami na logiciel LAS-X. Nsima ya kosala calibration ya bililingi, salelá ImageJ mpe Adobe Photoshop mpo na kosala lisusu elilingi mpe kobongisa ndenge moko kongɛnga mpe bokeseni. Salelá Adobe Illustrator mpo na kobongisa bililingi.
Analyse ya focus ya ADNmt. Motango ya ba lésions ya ADNmt e quantifiamaki na ba sections cérébelles marquées na ba anticorps contre ADN na microscope confocale. Etando moko na moko ya cible esalemaki mpo na nzoto ya selile mpe noyau ya selile moko na moko, mpe etando oyo etali yango esalemaki na nzela ya plug-in Multi Measure (logiciel ImageJ). Longola esika ya nikleere na esika ya nzoto ya baselile mpo na kozwa esika ya cytoplasme. Na suka, plug-in ya Analyse Particles (logiciel ImageJ) esalemaki mpo na ko quantifier automatiquement ba points ya ADN cytoplasmique oyo ezali kolakisa ADNmt na image ya seuil, mpe ba résultats oyo ezuami e normaliser na moyenne ya PN ya ba souris CTRL. Ba résultats elakisami lokola moyenne ya nombre ya ba nucléosides na cellule moko.
Analyse ya expression ya proteine. Salelá plug-in ya ImageJ ya Image Calculator mpo na kotalela expression ya proteine ​​na PN na niveau ya cellule moko. Na mokuse, na image confocale ya couche unique ya canal correspondant, na nzela ya équation : signal = min (mtYFP, anticorps), région mitochondriale oyo elakisaka immunréactivité na anticorps moko boye na Purkina e identifier. Na sima e quantifier zone ya pixel na masque oyo ezuami, et puis e normaliser na image ya seuil correspondante ya pile unique ya canal mtYFP pona kozua fraction mitochondriale ya proteine ​​oyo elakisami.
Analyse ya densité ya ba cellules ya Purkinje. Plug-in ya Cell Counter ya ImageJ esalelamaki mpo na kotala densité ya Purkinje na kokabolaka motango ya ba cellules ya Purkinje oyo etangami na bolai ya bague cérébellaire oyo ba cellules etangami ezwaki.
Bobongisi mpe bosangisi ya échantillon. Ba cerveaux oyo ewutaki na groupe témoin mpe ba souris Mfn2cKO e fixer na 2% PFA/2,5% glutaraldehyde na 0,1 M tampon phosphate (PB), mpe sima ba sections coronales e préparer en utilisant des ciliates (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienne, Autriche) (Epaisseur 50 à 60 μm) Na sima fixer na tampon PB na 1% ya tétraoxyde ya os mpe 1,5% ya ferrocyanure ya potassium na température ambiante na boumeli ya ngonga moko. Biteni yango esukolamaki mbala misato na mai distillé, mpe na nsima ekɔtisamaki na 70% ya éthanol oyo ezalaki na 1% ya acétate d’uranyle na boumeli ya miniti 20. Na nsima, biteni yango elongolamaki mai na masanga oyo ezwaki grade mpe ekɔtisamaki na résine époxy Durcupan ACM (résine de coulée Araldite M) (Electron Microscopy Sciences, nimero ya catalogue 14040) kati na ba lames ya verre oyo elatisami na silicium, mpe na nsuka na 60°C Polymériser na four na boumeli ya ngonga 48. Baponaki esika ya cortex cérébellaire mpe bakataki biteni ya 50 nm ultraminces na Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienne, Autriche) mpe bazwaki yango na grille ya fente ya cuivre ya 2×1 mm oyo elatisami na filme ya polystyrène. Ba sections e taché na solution ya acétate uranyle 4% na H2O pendant 10 minutes, esukolamaki na H2O mbala ebele, sima na citrate ya plomb Reynolds na H2O pendant 10 minutes, sima esukolamaki na H2O mbala ebele. Ba micrographies ezuami na microscope électronique ya transmission Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) na nzela ya caméra numérique TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, Etats-Unis). Allemagne).
Mpo na ba souris oyo bazwaki AAV, bakabolaki bɔɔngɔ mpe bakataki yango na eteni ya sagittal ya épaisseur ya 1 mm, mpe batalaki cerveau na nzela ya microscope ya fluorescence mpo na koyeba bague oyo ezwami na AAV (elingi koloba, mCherry oyo ezali kobimisa). Kaka ba expériences oyo injection ya AAV epesaka efficacité ya transduction très élevée ya couche cellulaire ya Purkinje (c.a.d. presque couche mobimba) na au moins deux bagues cérébelles oyo elandi nde esalelamaka. Boucle transduite na AAV e microdissecté pona butu mobimba post-fixation (4% PFA na 2,5% glutaraldehyde na tampon cocaate 0,1 M) pe e traité lisusu. Pona intégration ya EPON, ba tissus fixes esukolamaki na tampon ya cocoate de sodium 0,1 M (Applichem), pe e incuber na OsO4 2% (os, Science Services; Caco) na tampon ya cocoate de sodium 0,1 M (Applichem) 4 Heures, sima esukolamaki pendant 2 heures. Zongela mbala 3 na tampon ya cocamide 0,1 M. Na sima, basalelaki série ascending ya éthanol mpo na ko incuber solution moko na moko ya éthanol na 4°C na 15 minutes mpo na ko déshydrater tissus. Ba transférer tissus na oxyde de propylène mpe ba incuber butu mobimba na EPON (Sigma-Aldrich) na 4°C. Tia tissu na EPON ya sika na température ambiante pendant 2 heures, et puis intégrer yango na 62°C pendant 72 heures. Salelá ultramicrotome (Leica Microsystems, UC6) mpe mbeli ya diamant (Diatome, Biel, Suisse) mpo na kokata biteni ya 70 nm ultra mince, mpe kosala tache na acétate uranyle 1,5% na boumeli ya miniti 15 na 37°C, mpe kosala tache na solution ya citrate ya plomb miniti 4. Ba micrographies électroniques ezuami na nzela ya microscope électronique ya transmission JEM-2100 Plus (JEOL) oyo ezali na Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) mpe logiciel DigitalMicrograph (Gatan). Mpo na kosala analize, bazwaki ba micrographies électroniques na zoom numérique 5000× to 10.000×.
Analyse morphologique ya mitochondrie. Pona ba analyses nionso, ba contours ya mitochondrie individuelle e contourné manuellement na ba images numériques en utilisant logiciel ImageJ. Ba paramètres morphologiques ndenge na ndenge e analysé. Densité mitochondriale emonisami lokola pourcentage oyo ezwami na kokabolaka etando mobimba ya mitochondrie ya selile moko na moko na etando ya cytoplasme (etando ya cytoplasme = etando ya cellule-etando ya noyau ya selile) × 100. Ronde ya mitochondrie etangami na formule [4π∙(etando/périmètre 2)]. Morphologie ista ya mitochondrie e analysé mpe ekabolamaki na deux catégories (“tubulaire” mpe “blister”) selon ba shapes na yango ya minene.
Analyse ya nombre ya autophagosome/lysosome na densité. Salelá logiciel ImageJ mpo na kosala plan na maboko ba contours ya autophagosome/lysosome moko na moko na image numérique. Etando ya autophagosome/lysosome elakisami lokola pourcentage oyo etangami na kokabolaka etando mobimba ya structure autophagosome/lysosome ya cellule moko na moko na etando ya cytoplasme (etando ya cytoplasme=etando ya cellule-etando ya noyau)×100. Densité ya ba autophagosomes/lysosomes ezuami na kokabola motango mobimba na motango ya ba structures autophagosomes/lysosomes na cellule moko (na oyo etali etando ya cytoplasmique) (etando ya cytoplasmique = etando ya cellule-espace nucléaire).
Etiquetage mpo na section aiguë mpe préparation ya échantillon. Mpo na ba expériences oyo esengaka étiquetage ya glucose, transferer ba tranches ya cerveau aiguë na chambre avant incubation, oyo ezali na carbone saturé (95% O2 na 5% CO2), Ca2 + ACSF ya likolo (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampon phosphate de sodium, 25,0 mM NaHCO 3, 25,0 mM d-glucose, 1,0 mM CaCl 2 mpe 2,0 mM MgCl 2, ebongisami na pH 7,4 mpe 310 kino 320 mOsm), na kati na yango glucose ezali 13 C 6- Substitution ya glucose (Eurisotop, nimero ya catalogue CLM-1396). Mpo na ba expériences oyo esengaka étiquetage ya pyruvate, transferer ba tranches ya cerveau aiguë na Ca2 + ACSF ya likolo (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampon phosphate de sodium, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucose, 1,0 mM CaCl2 mpe Bakisa 2,0mM MgCl2, bongisa na pH 7,4 mpe 310 na 320mOsm), mpe bakisa 1mM 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop, nimero ya catalogue CLM-1082). Botia biteni na boumeli ya miniti 90 na 37°C. Na suka ya expérience, biteni esukolamaki noki na solution aqueuse (pH 7,4) oyo ezalaki na carbonate d’ammonium 75 mM, mpe na sima e homogénéisé na 40:40:20 (v:v:v) acétonitrile (ACN): methanol: mayi. Sima ya ko incuber biteni na glace pendant 30 minutes, ba échantillons e centrifugé na 21.000 g pendant 10 minutes na 4°C, mpe supernatant clair ekauki na concentrateur SpeedVac. Pellet ya métabolite oyo ekauki oyo ezwamaki ebombamaki na -80°C kino na analyse.
Analyse ya chromatographie liquide-spectrométrie de masse ya ba acides aminés 13 marqués na C. Pona analyse ya chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS), pellet ya métabolite e resuspendu na 75μl ya mayi ya grade LC-MS (Honeywell). Sima ya centrifugation na 21.000 g pendant 5 minutes na 4°C, 20 μl ya supernatant clarifié esalemaki pona analyse ya flux ya ba acides aminés, alors que extrait oyo etikali esalelamaki mbala moko pona analyse ya anion (tala na se). Analyse ya ba acides aminés esalemaki na nzela ya protocole ya dérivéisation ya chlorure de benzoyle oyo elobamaki liboso ( 55 , 56 ). Na étape ya liboso, 10μl ya carbonate de sodium 100 mM (Sigma-Aldrich) ebakisami na 20μl ya extrait ya métabolite, mpe na sima 10μl ya chlorure de benzoyle 2% (Sigma-Aldrich) ebakisami na ACN ya grade LC. Ba vortexer échantillon mua moke mpe na sima ba centrifugé na 21.000 g na boumeli ya 5 minutes na 20°C. Botiaka supernatant oyo elongolami na fiole autoéchantillonnage ya 2 ml na insert ya verre conique (volume 200 μl). Ba échantillons e analysé na nzela ya système LC ultra-haute performance Acquity iClass (Waters) oyo ekangami na spectromètre de masse ya précision ya haute résolution Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Pona analyse, 2μl ya échantillon dérivé e injecter na colonne T3 ya silice ya makasi ya 100×1,0 mm (Mai) oyo ezalaki na ba particules ya 1,8μm. Débit ezali 100μl/min, mpe système ya tampon ezali na tampon A (formate d’ammonium 10 mM mpe acide formique 0,15% na mayi) mpe tampon B (ACN). Gradient ezali boye : 0%B na 0 minutes ; 0%B. 0 kino 15% B na miniti 0 kino 0,1; 15 kino 17% B na miniti 0,1 kino 0,5; B na 17 kino 55% na miniti 0,5 kino 14; B na 55 kino 70% na miniti 14 kino 14,5; na 14,5 kino 70 kino 100% B na miniti 18; 100% B na miniti 18 kino 19; 100 kino 0% B na miniti 19 kino 19,1; 0% B na miniti 19,1 kino 28 (55, 56). Spectromètre de masse QE-HF esalaka na mode ionisation positive na intervalle ya masse ya m/z (ratio masse/charge) ya 50 à 750. Résolution oyo esalemi ezali 60.000, mpe cible ya ion ya contrôle ya gain (AGC) oyo ezuami ezali 3×106, mpe temps ya ion maximale ezali 100 millisecondes. Source ya ionisation électropulvérisation chauffée (ESI) esalaka na tension ya pulvérisation ya 3,5 kV, température capillaire ya 250°C, débit ya mopepe ya gaine ya 60 AU (unités arbitraires), mpe flux ya mopepe auxiliaire ya 20 AU. 250°C. Objectif S etiamaki na 60 AU.
Chromatographie anionique-analyse MS ya ba acides organiques marqués na 13C. Ba analyser précipité ya métabolite oyo etikali (55μl) na nzela ya système ya chromatographie ionique Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) oyo ekangami na spectromètre de masse QE-HF (Thermo Fisher Scientific). Na mokuse, 5μl ya extrait ya métabolite e injecter na colonne Dionex IonPac AS11-HC équipée na HPLC (2 mm×250 mm, taille ya particule 4μm, Thermo Fisher Scientific) na mode boucle partielle push-in na rapport ya remplissage ya 1. ) colonne ya garde Dionex IonPac AG11-HC (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientifique) ya mayele. Température ya colonne ebatelami na 30°C, mpe autoéchantillonneur etiemaka na 6°C. Salelá cartouche ya hydroxyde de potassium oyo epesami na mayi désionisée mpo na kobimisa gradient ya hydroxyde de potassium na nzela ya générateur ya eluant. Bokabwani ya ba métabolites na débit ya 380μl/min, kosalela gradient oyo : 0 à 3 minutes, 10 mM KOH; miniti 3 kino 12, 10 kino 50 mM KOH; miniti 12 kino 19, 50 kino 100 mM KOH; miniti 19 kino 21 , 100 mM KOH; 21 kino 21,5 minutes, 100 kino 10 mM KOH. Ba rééquilibre colonne na se ya 10 mM KOH na boumeli ya 8,5 minutes.
Ba métabolites elués esangani na courant ya supplément ya isopropanol ya 150μl/min sima ya colonne mpe sima e dirigé na spectromètre de masse ya haute résolution oyo ezali kosala na mode ionisation négative. MS ezali ko surveiller intervalle ya masse kobanda m/z 50 ti 750 na résolution ya 60.000. AGC etiamaki na 1×106, mpe tango ya ion ya likolo ebatelami na 100 ms. Source ESI oyo e chauffer esalemaki na tension ya pulvérisation ya 3,5 kV. Ba paramètres mosusu ya source ya ion ezali boye: température capillaire 275°C; koleka ya gaz ya gaine, 60 AU; débit auxiliaire ya gaz, 20 AU na 300°C, mpe setting ya objectif S na 60 AU.
Analyse ya ba données ya ba métabolites marqués na 13C. Salelá logiciel TraceFinder (version 4.2, Thermo Fisher Scientific) mpo na botangi ya ba données ya rapport ya isotope. Identité ya composé moko na moko e vérifié na composé ya référence ya kozala na confiance mpe e analysé indépendamment. Pona kosala analyse ya enrichissement ya isotope, etando ya chromatogramme d’ions extrait (XIC) ya isotope moko na moko ya 13C (Mn) ezuami na [M + H] +, esika n ezali nombre ya carbone ya composé cible, oyo esalelamaka pona ko analyser ba acides aminés to [ MH] + esalelami pona ko analyser ba anions. Bosikisiki ya masse ya XIC ezali na nse ya biteni mitano na milio moko, mpe bosikisiki ya RT ezali miniti 0,05. Analyse ya enrichissement esalemaka na calcul ya rapport ya isotope moko na moko oyo ezuami na somme ya ba isotopes nionso ya composé correspondant. Ba ratios oyo epesami lokola ba valeurs pourcentages pona isotope moko na moko, pe ba résultats elakisami lokola enrichissement molaire pourcentage (MPE), ndenge elobamaki liboso (42).
Pellet ya neurones congelé e homogénéisé na méthanol 80% (v/v) ya malili ya glace, e vortex, mpe e incuber na -20°C pendant 30 minutes. Vortex lisusu échantillon mpe koningisa na +4°C na boumeli ya miniti 30. Ba centrifugé échantillon na 21.000 g na boumeli ya miniti 5 na 4°C, mpe na sima supernatant oyo ezuami ezwamaki mpe ekaukisamaki na nzela ya concentrateur SpeedVac na 25°C mpo na analyse oyo elandi. Ndenge tolobeli yango awa na likoló, basalaki analize ya LC-MS na ba acides aminés ya baselile oyo ekabolamaki. Na kosalelaka TraceFinder (version 4.2, Thermo Fisher Scientific), analyse ya ba données esalemaki na nzela ya masse monoisotopique ya composé moko moko. Normalisation quantile ya ba données ya ba métabolites esalemaki na nzela ya ensemble logiciel preprocessCore ( 57 ).
Bobongisi ya tranche. Ba anesthésie ya soso noki na gaz carbonique mpe bakataki ye motó, balongolaki bɔɔngɔ nokinoki na mokuwa ya motó, mpe basalelaki mbeli oyo eningani oyo etondi na zɛlo (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Allemagne) mpo na kokata yango na biteni ya sagittale ya 300 tii 375 μm Gazification ya carbone malili (95% O2 mpe 5% CO2) Basse Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampon phosphate de sodium, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucose, 1,0 mM CaCl2 mpe 6,0 mM MgCl2 Bobongisa na pH 7,4 mpe 310 kino 330 mOsm). Botiaka ba tranches ya cerveau oyo ezuami na chambre oyo ezali na Ca2 + ACSF ya likolo (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampon phosphate de sodium, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucose, 4,0 mM CaCl2 mpe mM 3,5 MgCl2) pH 7,4 mpe 310 kino 320 mOsm). Bomba biteni yango na boumeli ya miniti 20 to 30 mpo ete bázongisa yango liboso ya kokanga yango.
enregistrement ya enregistrement. Etape ya microscope oyo ezali na chambre ya enregistrement fixe mpe objectif objectif d’immersion na mayi 20x (Scientifica) esalelamaki mpo na ba enregistrements nionso. Ba cellules présumées ya Purkinje ezuami na (i) taille ya nzoto, (ii) esika anatomique ya cerveau, mpe (iii) expression ya gène reporteur mtYFP fluorescent. Pipette ya patch oyo ezali na résistance ya pointe ya 5 à 11 megohms ebendamaka libanda na capillaire ya verre borosilicate (GB150-10, 0,86 mm×1,5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Allemagne) mpe na pipette horizontale Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA). Ba enregistrements nionso esalemaki na amplificateur ya pince ya patch npi ELC-03XS (npi electronic GmbH, Tam, Allemagne), oyo ezalaki contrôlé na logiciel Signal (version 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Royaume-Uni). Expérience e enregistrer na vitesse ya échantillonnage ya 12,5 kHz. Signal ezali filtré na deux filtres Bessel à passe courte na ba fréquences ya coupe ya 1,3 na 10 kHz respectivement. Capacitance ya membrane na pipette e compensé na circuit ya compensation na nzela ya amplificateur. Ba expériences nionso esalemaki sous contrôle ya caméra Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Allemagne), oyo ezalaki contrôlé na logiciel Hokawo (version 2.8, Hamamatsu, Gerden, Allemagne).
Configuration routine ya cellule mobimba mpe analyse. Mbala moko yambo ya kokoma, tondisa pipette na solution ya kati oyo ezali na biloko oyo : 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM ya gluconate de potassium, 10,0 mM ya Hepes, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM Guanosine triphosphate (GTP) (Na) mpe 10,0 mM ya phosphate ya créatinine ebongisamaki na pH 7,25, mpe pression osmotique ezalaki 290 mOsm (saccharose). Mbala moko nsima ya kosalela nguya ya 0 pA mpo na kopasola membrane, bamekaki potentiel ya membrane oyo epemaki. Résistance ya entrée emekamaka na kosalela ba courants hyperpolarisés ya -40, -30, -20, na -10 pA. Meka bonene ya eyano ya tension mpe salelá mobeko ya Ohm mpo na kosala calcul ya résistance ya entrée. Activité spontanée ekomamaki na pince ya tension na boumeli ya miniti 5, mpe sPSC e identifier mpe emekamaki na Igor Pro (version 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) na kosalelaka script ya reconnaissance semi-automatique. Courbe IV mpe courant ya état stationnaire emekamaka na kokanga pile na ba potentiels différents (kobanda na -110 mV) mpe komatisaka tension na ba étapes ya 5 mV. Bamekaki kobimisama ya AP na kosaleláká courant dépolarisant. Clamper cellule na -70 mV tango ozali ko appliquer pulse ya courant dépolarisation. Bongisa taille ya étape ya unité moko na moko ya enregistrement separatement (10 à 60 pA). Calculer fréquence maximale ya AP na kotanga manuellement ba spikes ya pulsation oyo esalaka fréquence ya AP ya likolo. Seuil ya AP e analysé na kosalelaka dérivé ya mibale ya pulse ya dépolarisation oyo e déclenchaka liboso AP moko to ebele.
Configuration ya patch perforés na analyse. Sala enregistrement ya patch perforés na nzela ya ba protocoles standard. Salelá pipette oyo ezali na ATP mpe GTP te oyo ezali na biloko oyo te: 128 mM gluconate K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA mpe 2 mM MgCl2, mpe bongisa na pH 7,2 (na kosaleláká KOH). ATP mpe GTP elongolami na solution intracellulaire mpo na kopekisa perméabilité incontrôlée ya membrane cellulaire. Pipette ya patch etondisami na solution ya kati oyo ezali na amphotéricine (pene na 200 kino 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) mpo na kozwa enregistrement ya patch oyo e punched. Amphotéricine epanzani na diméthyl sulfoxyde (concentration ya suka: 0,1 kino 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Concentration ya DMSO oyo esalelamaki ezalaki na effet ya significatif te na ba neurones oyo bayekolaki. Na tango ya procédé ya poinçon, résistance ya canal (Ra) ezalaki continuellement surveillé, mpe expérience ebandaki après amplitude ya Ra na AP stabilisé (20-40 minutes). Activité spontanée emekamaka na pince ya tension mpe/to ya courant na boumeli ya miniti 2 kino 5. Analyse ya ba données esalemaki na nzela ya Igor Pro (version 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (version 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) pe GraphPad Prism (version 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). États-Unis). Pona koyeba ba APs spontanées, plug-in ya NeuroMatic v3.0c ya IgorPro esalelami. Koyeba automatiquement ba AP na kosalelaka seuil oyo epesami, oyo ebongisami moko moko pona enregistrement moko na moko. Na kosalelaka intervalle ya spike, yeba fréquence ya spike na fréquence maximale ya spike instantané mpe fréquence moyenne ya spike.
Isolement ya PN. Na ko s’adapter na protocole oyo ebimisamaki liboso, ba PNs e purifié na cerveau ya soso na étape moko précisé ( 58 ). Na mokuse, bakataki cerveau mpe bakataki yango na milieu ya dissociation oyo ezali malili lokola glace [kozanga HBSS Ca2+ mpe Mg2+, babakisaki glucose 20 mM, pénicilline (50 U/ml) mpe streptomycine (0,05 mg/ ml)], mpe na nsima ba digérer milieu yango na papaine [HBSS, oyo ebakisami na 1-cysteine·HCl (1 mg/ml), papaïne (16 U/ml) mpe désoxyribonucléase I (ADNase I; 0,1 mg/ml)] Salisa yango na boumeli ya miniti 30 na 30°C. Ya liboso kosukola ba tissus na milieu HBSS oyo ezali na mucus ya makei (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) mpe DNase (0,1 mg/ml) na température ambiante mpo na kopekisa digestion enzymatique, mpe na sima na milieu HBSS oyo ezali na 20 mM ya glucose Konika malembe na HBSS, pénicilline (50 U/ml), streptomycine (0,05 mg/ml) mpe DNAse (0,1 mg/ml) ebimisaka baselile moko. Suspension cellulaire oyo ezuami e filtraki na nzela ya filtre cellulaire ya 70μm, sima ba cellules e pelleté na centrifugation (1110 rpm, 5 minutes, 4°C) mpe e resuspendu na milieu ya triage [HBSS, ebakisami na 20 mM ya glucose, 20% ya fœtus bovine ) Sérum, pénicilline (50 U/ml) mpe streptomycine (0,05 mg/ml)]; kotalela bomoi ya baselile na iodure ya propidium mpe kobongisa densité ya baselile na 1×106 kino 2×106 baselile/ml. Yambo ya cytométrie ya flux, ba filtraki suspension na nzela ya tamis cellulaire ya 50 μm.
Cytomètre ya écoulement. Botangi ya ba cellules esalemaki na 4°C na nzela ya machine FACSAria III (BD Biosciences) mpe logiciel FACSDiva (BD Biosciences, version 8.0.1). Suspension cellulaire e classer na nzela ya buse ya 100 μm na pression ya 20 psi na vitesse ya ~2800 événements/sec. Lokola ba critères ya gating ya bonkoko (taille ya cellule, discrimination bimodale, mpe ba caractéristiques ya dispersion) ekoki te ko assurer isolement correct ya PN na ba types ya cellules misusu, stratégie ya gating etiamaki na base ya comparaison directe ya intensité ya YFP na autofluorescence na mitoYFP+ ​​mpe na mitoYFP − Souris témoins. YFP esepelisami na ko irradier échantillon na ligne ya laser ya 488 nm, mpe signal e détecté na nzela ya filtre ya passe ya bande ya 530/30 nm. Na ba souris mitoYFP+, makasi ya relative ya gène reporteur Rosa26-mitoYFP esalelamaka mpe mpo na kokesenisa nzoto ya neuronale mpe biteni ya axon. 7-AAD e excité na laser jaune ya 561 nm mpe e détecté na filtre ya passe de bande 675/20 nm mpo na ko exclure ba cellules mortes. Mpo na kokabola ba astrocytes na ntango moko, ba taché suspension cellulaire na ACSA-2-APC, sima ba irradier échantillon na ligne laser ya 640 nm, mpe basalelaki filtre ya passe de bande ya 660/20 nm mpo na ko détecter signal.
Ba cellules oyo esangisi e pelleté na centrifugation (1110 rpm, 5 minutes, 4°C) mpe ebombamaki na -80°C tii tango bakosalela yango. Ba souris Mfn2cKO na ba pups na bango ya poubelle ba classifier na mokolo moko pona ko minimiser variabilité procédurale. Bolakisi pe botangi ya ba données ya FACS esalemaki na nzela ya logiciel FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Ndenge tolobaki yango likolo (59), PCR en temps réel esalelamaka pona ko isoler ADN na ba neurones oyo e classé pona quantification ya mtDNA oyo elandi. Linearité mpe sensibilité ya seuil emekamaki na ebandeli na kosala qPCR na ba nombres différents ya ba cellules. Na mokuse, kosangisa 300 PN na tampon ya lyse oyo ezali na 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 mpe proteinase K (200 ng/ml) mpe ko incuber na 55°C 120 minutes. Ba cellules e incuber lisusu na 95°C na 10 minutes pona ko assurer inactivation complete ya proteinase K. Na kosalelaka sonde TaqMan (Thermo Fisher) spécifique na mt-Nd1, mtDNA e mezamaki na PCR semi-quantitative na système ya 7900HT Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific). Science, nimero ya catalogue Mm04225274_s1), ba gènes mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, nimero ya catalogue AIVI3E8) mpe 18S (Thermo Fisher Scientific, nimero ya catalogue Hs99999901_s1).
Bobongisi ya échantillon ya proteine. Na ko chauffer solution na 95°C pendant 10 minutes pe sonication, na tampon ya lyse [chlorure de guanidine 6 M, chlorhydrate de phosphine tris(2-carboxyéthyl) 10 mM, chloroacétamide 10 mM na ba pellets ya neurones congelées tris- Lyse 100 mM na HCl]. Na Bioruptor (Diagenode) pendant 10 minutes (30 secondes pulse / 30 secondes période ya pause). Échantillon e dilué 1:10 na 20 mM tris-HCl (pH 8,0), esangani na 300 ng ya wolo ya trypsine (Promega), mpe e incuber butu mobimba na 37°C mpo na kozua digestion mobimba. Na mokolo ya mibale, ba centrifugé échantillon na 20.000 g na boumeli ya miniti 20. Ba dilué supernatant na acide formique 0,1%, mpe ba désallé solution na ba StageTips oyo basalaki bango moko. Échantillon ekauki na instrument SpeedVac (Eppendorf concentrator plus 5305) na 45°C, mpe na sima peptide e suspendu na acide formique 0,1%. Ba échantillons nionso ebongisamaki na mbala moko na mutu moko. Pona ko analyser ba échantillons ya ba astrocytes, 4 μg ya ba peptides désalés e marqué na étiquette ya masse tandem (TMT10plex, numéro ya catalogue 90110, Thermo Fisher Scientific) na rapport peptide na réactif TMT ya 1:20. Mpo na marquage ya TMT, 0,8 mg ya réactif TMT e resuspendu na 70 μl ya ACN anhydre, mpe peptide oyo ekauki e reconstituer na 9 μl ya 0,1 M TEAB (bicarbonate de triéthylammonium), na yango 7 μl ya réactif TMT na ACN ebakisami. Concentration ezalaki 43,75%. Sima ya 60 minutes ya incubation, réaction esili na 2 μl ya hydroxylamine 5%. Ba peptides oyo etiamaki bilembo ezwamaki, ekaukisamaki, ezongisamaki na suspension na 200μl ya acide formique 0,1% (FA), ekabolamaki na mibale, mpe na nsima elongolamaki mungwa na kosalelaka StageTips oyo basalaki bango moko. Na kosalelaka chromatographe liquide ultra haute performance UltiMate 3000 (chromatographe liquide ultra haute performance UltiMate 3000), moko ya ndambo mibale e fractionné na colonne chromatographique Acquity ya 1mm x 150mm oyo etondisami na ba particules C18 ya 130Å1.7μm (Waters, catalogue No. SKU: 186006935). Thermo Fisher Moto ya siansi). Bokabola ba peptides na débit ya 30μl/min, bokabwana na 1% kino 50% ya tampon B na boumeli ya miniti 85 na gradient ya étapes ya miniti 96, kobanda na 50% kino 95% ya tampon B na boumeli ya miniti 3, na nsima miniti 8 mpo na tampon B 95 %; Tampon A ezali 5% ACN mpe 10 mM bicarbonate d’ammonium (ABC), mpe tampon B ezali 80% ACN mpe 10 mM ABC. Sangisa ba fractions chaque 3 minutes mpe kosangisa yango na deux groupes (1 + 17, 2 + 18, etc.) mpe kokaukisa yango na centrifugeuse à vide.
Botangi ya LC-MS/MS. Pona spectrométrie ya masse, ba peptides (numéro r119.aq) ekabolamaki na colonne analytique PicoFrit ya 25 cm, diamètre interne ya 75 μm (objectif ya sika, numéro ya pièce PF7508250) équipé na milieu ReproSil-Pur 120 C18-AQ ya 1,9 μm (Dr. Maisch, mat), kosalela EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, na Allemagne). Bazalaki kobatela colonne yango na 50°C. Ba tampons A na B ezali 0,1% ya acide formique na mayi mpe 0,1% ya acide formique na 80% ya ACN, respectivement. Ba peptides ekabolamaki uta 6% kino 31% tampon B na boumeli ya miniti 65 mpe uta na 31% kino 50% tampon B na boumeli ya miniti 5 na gradient ya 200 nl/min. Ba peptides elués e analysé na spectromètre de masse Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Mesure ya précurseur ya peptide m/z esalemaka na résolution ya 120.000 na intervalle ya 350 à 1500 m/z. Na kosalelaka 27% ya énergie ya collision normalisée, précurseur ya makasi oyo ezali na état ya charge ya 2 à 6 eponami mpo na clevage ya dissociation ya piège C ya énergie makasi (HCD). Tango ya cycle etiamaki na 1 s. Valeur m/z ya fragment peptide e mezamaki na piège ya ions na nzela ya cible ya AGC ya moke ya 5×104 mpe temps maximum ya injection ya 86 ms. Sima ya fragmentation, précurseur etiemaki na liste ya exclusion dynamique pendant 45 s. Ba peptides marqués na TMT ekabolamaki na colonne Acclaim PepMap ya 50 cm, 75 μm (Thermo Fisher Scientific, numéro ya catalogue 164942), mpe ba spectres ya migration e analysé na spectromètre de masse Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) équipé na équipement ya ba ions asymétriques ya champ haut (FAIMS). (Thermo Fisher Scientific) esalaka na ba tensions mibale ya compensation ya −50 na −70 V. MS3 oyo eponami na kotalaka précurseur ya synchronisation esalelamaka pona mesure ya signal ion ya rapport TMT. Bokabwani ya peptide esalemaki na EASY-nLC 1200, na kosalelaka élution gradient linéaire ya 90%, na concentration ya tampon ya 6% kino 31%; tampon A ezalaki 0,1% FA, mpe tampon B ezalaki 0,1% FA mpe 80% ACN. Kolona ya analyse esalemaka na 50°C. Salelá FreeStyle (version 1.6, Thermo Fisher Scientific) mpo na kokabola fichier original selon tension ya compensation ya FAIMS.
Identification ya proteine ​​mpe quantification. Na kosalelaka moteur de recherche intégré Andromeda, ba données originales e analysé na nzela ya MaxQuant version 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). En plus ya ba séquences ya Cre recombinase na YFP oyo ezuami na Aequorea victoria, ba spectres ya fragment ya peptide elukamaki pona séquence canonique na séquence isoforme ya protéome ya référence ya soso (Protéome ID UP000000589, téléchargé na UniProt na mai 2017) . Oxydation ya méthionine mpe acétylation N-terminale ya proteine ​​etiamaki lokola ba modifications variables; méthylation ya carbamoyle ya cystéine etiamaki lokola ba modifications fixes. Ba paramètres ya digestion etiamaki na « spécificité » na « trypsine/P ». Motángo ya moke ya ba peptides mpe ba peptides ya rasoir oyo basalelaka mpo na koyeba proteini ezali 1; nombre minimum ya ba peptides unique ezali 0. Na ba conditions ya matching ya carte ya peptide, taux ya identification ya proteine ​​ezalaki 0,01. Option “Peptide ya mibale” ezali activé. Salelá option “match between runs” mpo na kopesa ba identifications oyo elongi kati na ba fichiers originales ndenge na ndenge. Salelá motango ya ratio ya moke ya LFQ 1 mpo na quantification sans étiquette (LFQ) (60). Intensité ya LFQ e filtrer pona au moins deux valeurs valides na groupe génotype ata moko na point de temps moko moko, pe e extrapolé à partir ya distribution normale na largeur ya. 0.3 mpe kokita na nse 1.8. Salelá plateforme informatique Perseus (https://maxquant.net/perseus/) mpe R (https://r-project.org/) mpo na kosala analize ya ba résultats ya LFQ. Test ya t moyenne à deux voies oyo ewutaki na ensemble logiciel limma esalemaki pona analyse ya expression différentielle (61). Analyse exploratoire ya ba données esalemi na nzela ya ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally na pheatmap. Ba données ya protéomique oyo esalemi na TMT e analysé na nzela ya MaxQuant version 1.6.10.43. Boluka ba données brutes ya protéomique na base de données ya proteomique humaine ya UniProt, oyo e téléchargé na septembre 2018. Analyse ezali na facteur ya correction ya purité ya isotope oyo epesami na fabricant. Salelá limma na R mpo na analyse ya expression différentielle. Ba données originales, ba résultats ya boluki ya base de données, pe flux ya mosala ya analyse ya ba données pe ba résultats nionso ebombami na alliance ya ProteomeXchange na nzela ya ebombelo ya partenaire PRIDE na identifiant ya ensemble ya ba données PXD019690.
Ba annotations fonctionnelles e enrichir analyse. Esaleli ya Analyse ya nzela ya mayele (QIAGEN) esalelamaki pona koyeba bomengo ya ba termes ya annotation fonctionnelle ya ensemble ya ba données na poso 8 (Figure 1). Na mokuse, liste quantitative ya ba protéines oyo ezuami na analyse ya ba données LC-MS/MS (spectrométrie de masse en tandem) esalelami na ba critères ya filtre oyo : Mus musculus eponami lokola espèce pe fond, pe catégorie elakisaka valeur P oyo ebongisami na Benjamini pona enrichissement 0,05 to na se etalelami lokola ya motuya. Pona graphique oyo, ba catégories mitano ya likolo ya likolo na cluster moko moko oyo esalemi na valeur P ajustée elakisami. Na kosalelaka t-test multiple, na kosalelaka programme ya boost linéaire ya deux étapes ya Benjamini, Krieger, na Yekutieli (Q = 5%), analyse ya expression ya proteine ​​na cours ya temps esalemi na ba candidats importants oyo ezuami na catégorie moko na moko, mpe molongo moko na moko e analysé separatement. Ezali na ntina te ya kozwa SD oyo ezali ntango nyonso.
Pona ko comparer ba résultats ya études oyo na ba bases de données publiées pe ko produire diagramme ya Venn na figure 1, tosangisi liste quantitative ya ba protéines na ba annotations ya MitoCarta 2.0 ( 24 ). Salelá esaleli ya internet Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) mpo na kobimisa diagramme.
Mpo na koyeba makambo ya sikisiki na ntina na ba procédures statistiques oyo esalelamaka mpo na analyse ya protéomique, tala eteni oyo ekokani na yango ya Matériaux et Méthodes. Mpo na ba expériences mosusu nionso, ba informations détaillées ekoki kozwama na lisapo oyo ekokani na yango. Soki elakisami te, ba données nionso elakisami lokola moyenne ± SEM, pe ba analyses statistiques nionso esalemaki na nzela ya logiciel GraphPad Prism 8.1.2.
Mpo na biloko ya kobakisa mpo na lisolo oyo, talá http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
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Na E. Motori, I. Atanassov, S. M. V. Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson, oyo azali
Analyse protéomique ya ba neurones dysfonctionnelles emonisaki que ba programmes métaboliques e activer pona ko contrer neurodégénérescence.
Na E. Motori, I. Atanassov, S. M. V. Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson, oyo azali
Analyse protéomique ya ba neurones dysfonctionnelles emonisaki que ba programmes métaboliques e activer pona ko contrer neurodégénérescence.
©2020 Lisanga ya Amerika mpo na botomboli mayele ya siansi. makoki nyonso mazali ya yo. AAAS ezali partenaire ya HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef mpe COUNTER. Bokoli ya siansi ISSN 2375-2548.