Lelo†Adresse ya lelo: OX11 0DE, Royaume-Uni, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, Royaume-Uni, Diamond Light Source Co., Ltd., Centre d’imagerie biologique électronique.
Complexe 1 ya kobuka pole ya centre ya réaction (RC-LH1) ezali composante photosynthétique ya moboko ya bactérie phototrophiques violets. To kotisaki ba structures mibale ya microscopie cryo-électronique ya complexe RC-LH1 oyo ewutaki na Rhodopseudomonas palustris. Structure ya résolution ya 2,65-Å ya complexe RC-LH114-W ezali na 14 sous-unité LH1 boucles oyo ezingami na RC, oyo ekatamaki na proteine ​​W, alors que complexe oyo ezangi proteine-W ezali entièrement composition RC ezingami na RC. Ekangami 16 sous-unité LH1 boucle. Kokokanisa ba structures oyo epesi ba insights na dynamique ya quinone na complexe RC-LH1, y compris ba changements conformationnels oyo e déterminé liboso te tango ya liaison ya quinone na site ya RC QB, ainsi que esika ya ba sites auxiliaires ya liaison ya quinone, oyo esalisaka Koleka yango na RC. Struktur unique ya proteine ​​W epekisaka bokangami ya boucle LH1, na yango esala canal mpo na ko accélérer échange ya quinone/quinolone.
Energie oyo photosynthèse epesaka ekoki kobatela pene na bikelamu nyonso oyo ezali na mabele, mpe ezali na makoki mingi mpo na biotechnologie ya moi. Atako ezali kolendisa photosynthèse mondiale, bactérie phototrophiques violets elakisaka mpe ba modes ya énergie ndenge na ndenge mpe makoki ya métabolisme. Bakoki kokima photosynthèse mpe kokola lokola bactérie hétérotrophiques na molili, ekoki kobongisa azote mpe gaz carbonique, kobimisa hydrogène, mpe kobebisa ba composés aromatiques (1-3). Mpo na kopesa nguya mpo na misala yango, esengeli kobongola pole nokinoki mpe na ndenge ya malamu na nguya ya chimique. Processus oyo ebandaka tango complexe ya antenne oyo ekangami na lumière e absorber lumière mpe e transférer énergie oyo ekangami na centre ya réaction (RC), na yango ebandi separation ya charge (4 – 7). Unité ya base ya photosynthèse na bactérie phototrophiques violettes ezali composée na type 2 RC, ezingami na complexe ya récolte ya lumière 1 (LH1), oyo esali complexe ya noyau RC-LH1. LH1 esalemi na molɔngɔ ya ba hétérodimères αβ oyo ezali kobalusama, oyo mokomoko na yango ekangisaka ba molécules mibale ya chlorophylle bactérienne (BChl) a mpe caroténoïdes moko to mibale (8-12). Antenne LH1 oyo eleki pete ezali na ba hétérodimères αβ 16 to 17 oyo ezingami na RC (9-13) na boucle fermée, kasi na ba complexes mosusu ya noyau, ba peptides transmembranes ekata continuité ya LH1 oyo ezali zinga zinga , Na yango e promouvoir diffusion ya quinol/quinone entre RC na complexe cytochrome bc1 (11, 13-15). Plante phototrophique violet Rhodopseudomonas (Rps.) ezali organisme modèle oyo ekoki ko comprendre transfert ya énergie na électrons oyo e soutenir photosynthèse. Structure cristalline ya liboso ya Rps. Modèle ya complexe palustris RC-LH1 ezali RC, ezingami na 15 boucles hétérodimériques LH1, oyo ekatamaka na proteine ​​oyo eyebani te oyo babengi “Protéine W” (14). Na nsima, bayebaki proteine-W lokola RPA4402, oyo ezali proteine ​​ya 10,5kDa oyo eyebani te mpe ezali na ba hélices transmembranes (TMH) misato oyo esakolamaki ( 16 ). To proposer ko changer kombo ya gène rpa4402 oyo e coder proteine ​​W na pufW po ezala na boyokani na nomenclature oyo esalelamaka pona ba gènes oyo e coder ba sous-unités RC-L, M (pufL, pufM) na LH1α, β (pufA, pufB). Likambo ya kokamwa, proteine-W ezali kaka na soki 10% ya RC-LH1, emonisaka Rps. palustris ebimisaka ba complexes mibale ekeseni ya RC-LH1. Awa, tozali kopesa lapolo ya ba structures cryo-EM (cryo-EM) ya haute résolution ya ba complexes mibale ya noyau, moko na proteine ​​W mpe 14 hétérodimères αβ, mosusu sans proteine ​​W mpe boucle fermée 16 Hétérodimères LH1. Structure na biso ezali ko représenter changement ya étape na compréhension ya complexe RC-LH1 ya Rps. palustris, mpo to analyser population homogène ya variante moko na moko mpe tozali na résolution suffisante mpo na ko assigner clairement peptide moko na moko mpe ba pigments liés mpe ba lipide mpe ba quinones oyo etali yango. Kokokanisa ba structures oyo elakisaka que ba protéines misato ya TMH-W oyo ezwami te na complexe mosusu ya RC-LH1 tii sikoyo ebimisaka canal ya quinone mpo na ko accélérer échange ya quinone/quinolone. Un certain nombre ya ba sites conservés ya liaison lipide na quinone ezuami, mpe to dévoiler changement conformationnel ya sika sima ya combinaison ya quinone na RC, oyo ekoki kozala approprié pona photosystème II (PSII) RC ya ba organismes phototrophiques oxygéniés. Ba résultats na biso epesi ba insights ya sika na cinétique ya liaison mpe échange ya quinone/quinolone na complexe ya noyau RC-LH1 ya bactérie phototrophiques violets.
Pona ko faciliter étude détaillée ya ba complexes mibale oyo ezwami na Rps. palustris, to isoler RC-LH1 moko na moko na ba méthodes biochimiques. Complexe oyo ezangi proteine ​​W (oyo na sima bakobenga ΔpufW) epɛtolamaki na souche oyo ezangi gène pufW ( 16 ), mpe kaka complexe moko ya RC-LH1 nde ekoki kobimisama. Complexe oyo ezali na proteine ​​W esalemaka na souche moko. Protéine W ya souche oyo e modifier na étiquette His 10x na C-terminus na yango, na ndenge ete complexe oyo ezali na proteine ​​W ekoki kosangisama malamu na proteine ​​W oyo ezangi mingi na ko immobiliser métal. Complexe yango ekabwani malamu (16) Chromatographie d’affinité (IMAC).
Ndenge elakisami na figure 1, ba complexes nionso mibale ezali na RC ya sous-unité misato (RC-L, RC-M na RC-H) oyo ezingami na antenne LH1. Structure ya 2,80-A ya complexe oyo ezangi proteine-W ezali kolakisa ba hétérodimères αβ 16, oyo esali boucle LH1 fermée oyo ezingami mobimba na RC, oyo na sima bakobenga complexe RC-LH116. Struktur ya 2,65Å ya complexe oyo ezali na proteine-W ezali na LH1 ya 14 hétérodimères oyo ekatamaki na proteine-W, oyo ekobengama na sima RC-LH114-W.
(A mpe B) Bolakisi ya likolo ya mosangani. (C mpe D) Ba pigments oyo ekangami oyo emonisami na ba fimbo. . complexe ya ba sphaéroïdes (13)]. Mpo na LH1-α, langi ya sous-unité ya proteine ​​ezali jaune; mpo na LH1-β, langi ya sous-unité ya proteine ​​ezali bleu; mpo na proteine-W, proteini yango ezalaka motane; mpo na RC-H, ezali cyan; mpo na RC-L, ezali Orange; mpo na RC-M, magenta. Ba cofacteurs ezali komonisama na ba fimbo, vert ezali komonisa ba molécules ya BChl mpe BPh a, violet ezali komonisa ba caroténoïdes, mpe jaune ezali komonisa ba molécules ya UQ10. (G mpe H) Vue magnifiée ya écart ya proteine-W na région équivalente ya complexe RC-LH114-W (G) mpe complexe RC-LH116 (H). Ba cofacteurs elakisami na forme ya remplissage ya espace, quinone chélé elakisami na bleu. Espace ya proteine-W emonisami na ligne bleu pointillée na (G), mpe mabulu ya mike esika quinone/quinolol epalangani na bague LH116 elakisami na ligne pointillée ya moindo na (H).
Figure 1 (A na B) ezali kolakisa RC oyo ezingami na ba arrays ouvertes to fermés ya ba hétérodimères LH1αβ, moko na moko ekangisaka BChl mibale mpe caroténoïde moko (Figure 1, C mpe D). Ba études ya kala elakisaki que Rps ezali complexe LH1. Na nzela ya biosynthétique ya xanthin ya spiruline, mitindo yango ezali na ba populations mélangées ya ba caroténoïdes ( 17 ). Kasi, spiropyrroxanthin ezali caroténoïde oyo eleki mingi mpe densité na yango ezali kosepelisa. Yango wana, toponaki kosala modèle ya spiroxanthin na bisika nyonso oyo LH1 ekangamaka. Ba polypeptides alpha na beta ezali ba TMH moko na ba régions ya libanda ya membrane ya mikuse (Figure 1, A, B, E, na F). Atako densité ya ba résidus 17 na C-terminus emonanaki te, polypeptide alpha ekabwanaki na Met1 kino Ala46 na ba complexes nionso mibale. Polypeptide β ekitisami uta na Gly4 kino na Tyr52 na RC-LH116, mpe uta na Ser5 kino na Tyr52 na RC-LH114-W. Densité ya 3 to 4 N-terminaux to 13 C-terminaux résidus emonanaki te (Figure S1). Analyse ya spectrométrie masse ya complexe RC-LH1 mélangé oyo ebongisamaki na souche ya type sauvage elakisaki que région oyo ezangi ezalaki résultat ya clevage hétérologue ya ba peptides oyo (Figure S1 et S2). Formylation N-terminale ya α-Met1 emonanaki mpe (f). Analyse elakisaki que α-peptide ezali na ba résidus fMet1 à Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, mpe β-peptide ezali na ba résidus Ser2 à Ala53, oyo ezali na boyokani malamu na carte ya densité ya EM ya température moke.
Coordination ya α-His29 na β-His36 esalaka que ba BChls miso na miso; hétérodimère moko na moko ya αβ esanganaka na ba voisins na yango mpo na kosala boucle ouverte (RC-LH114-W) to boucle fermée (RC-LH116) zinga zinga ya RC The exciton coupled pigment array (Figure 1, C and D). Soki tokokanisi yango na bande ya 877 nm ya RC-LH114-W, déplacement rouge ya absorption ya 880 nm ya RC-LH116 ezali 3 nm (Figure 2A). Kasi, spectre ya dichroisme circulaire ezali pene na ndenge moko (Figure 2B), elakisi ete atako bokeseni ya polele ezali kati ya boucles ouvertes na boucles fermées, environnement local ya BChls ekokani mingi. Déplacement rouge ya absorption ekoki kozala résultat ya réduction ya mouvement thermique mpe augmentation ya stabilité na boucle fermée (18, 19), changement ya couplage ya pigment oyo esalemi na boucle fermée (20, 21), to combinaison ya ba effets oyo mibale (11).
(A) Spectre ya absorption ultraviolet/visible/proche-infrarouge, ba sommets na yango ezali marqués na ba pigments correspondants na yango mpe normalisé na sommet ya BPh na 775 nm. (B) Spectre ya dichroisme circulaire normalisé na absorbance ya BChl na 805 nm. (C mpe D) Ba spectres ΔA oyo eponami na ba spectres ya absorption résolus na temps ya complexe RC-LH114-W (C) mpe complexe RC-LH116 (D). Mpo na bokokanisi malamu, ba spectres nionso e normaliser na ∆A ya −A na 0,2 ps. (E) Taux ya oxydation ya cytochrome c2 sima ya irradiation na présence ya ba concentrations ndenge na ndenge ya UQ2 (tala Figure S8 pona ba données brutes). (F) Na ba cellules oyo ekolisami na se ya lumière ya makasi ya nse, ya moyenne to ya makasi (10, 30 to 300μMm-2 s-1, respectivement), ba sous-unités ya proteine ​​W na RC-L na complexe purifié mpe rapport ya membrane oyo ekabwani. Boyeba niveau ya proteine ​​na nzela ya électrophorèse na gel SDS-polyacrylamide mpe immunoessay (tala Figure S9 mpo na ba données brutes). Boyeba rapport par rapport na complexe RC-LH114-W oyo epɛtolami. Rapport stoéchiométrique ya RC-L na proteine-W ya complexe ezali 1:1.
Ba BChls na position 1 na boucle αβ14 déformée ya RC-LH114-W (Figure 1, A, C, na E) ezali pene na donneur primaire ya RC (P) na 6,8Å koleka ba BChls équivalents na RC-LH116 (Figure. 1, B, D, na F, na Figure S3); nzokande, cinétique ya absorption transitoire ya ba complexes mibale elakisaka que pona RC-LH114-W na RC-LH116, ba constantes ya temps ya transfert ya énergie ya excitation depuis LH1 ti na RC ezali 40 ±4 na 44±3 ps (Figure 2). , C mpe D, Figure S4 mpe Tableau S2). Bokeseni ya monene pe ezali te na transfert électronique na kati ya RC (Figure S5 pe texte supplémentaire oyo etali yango). To suspecter que correspondance proche ya temps ya transfert d’énergie entre LH1 na RC-P ezali mpo na distance, angle na énergie potentielle ya ndenge moko ya mingi ya BChl na ba boucles mibale ya LH1. Emonani lokola ete kotala motindo ya nguya ya LH1 mpo na kokoma na ntaka ya moke ezali mbangu te koleka bopanzi ya nguya ya semba uta na bisika ya suboptimal kino na RC. Boucle LH1 ya boucle ouverte na RC-LH114-W ekoki pe ko subir mouvement thermique insignifiant na conditions ya température ya se pona analyse structurelle, pe ezali na conformation ya bague αβ14 ya molayi na température ambiante à partir ya distance ya pigmentation ya βBChls na position ya RC 1.
Complexe RC-LH116 ezali na 32 BChls mpe 16 caroténoïdes, mpe ebongiseli na yango mobimba ezali ndenge moko na oyo ezwami na Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 souche ( PDB ID 7C9R) (12) mpe vert algues (Blc.viridis) (ID ya PDB 6ET5) (10). Sima ya alignment, kaka ba déviations ya mike mike na ba positions ya ba hétérodimères αβ nde emonanaki, surtout 1-5, 15, na 16 (Figure S6). Kozala ya proteine-W ezali na bopusi monene na structure ya LH1. Ba TMH na yango misato ekangami na ba boucles mikuse, na N-terminal na côté lumen ya complexe mpe C-terminal na côté cytoplasmique (Figures 1A et 3, A à D). Protéine-W ezali mingi mingi hydrophobe (Figure 3B), mpe TMH2 mpe TMH3 esalaka na LH1αβ-14 mpo na kosala surface transmembrane (Figure 3, B mpe E kino G). Interface ezali mingi mingi na ba résidus Phe, Leu na Val na région transmembrane. Ba résidus wana ekangamaka na ba acides aminés hydrophobes mpe na ba pigments αβ-14. Ba résidus polaires mosusu pe esalisaka na interaction, na kati na yango liaison hydrogène entre W-Thr68 na β-Trp42 na surface ya cavité complexe (Figure 3, F na G). Na likolo ya cytoplasme, Gln34 ezali pembeni ya groupe céto ya ba caroténoïdes αβ-14. Longola yango, molécule ya n-dodécyl β-d-maltoside (β-DDM) esili, mpe mokila na yango oyo ezalaki hydrophobe ekómaki tii na esika oyo proteine-W mpe αβ-14 ezali, mpe mokila ya lipide ekoki kozala na nzoto. To remarqué pe que ba régions ya résolution C-terminale ya proteine ​​W na RCH ezali très proches, mais na kati ya portée ya kosala ba interactions spécifiques te (Figure 1, A et E). Kasi, ekoki kozala na ba interactions na ba acides aminés C-terminaux oyo esili te ya ba protéines oyo mibale, oyo ekoki kopesa mécanisme ya recrutement ya proteine-W na tango ya assemblage ya complexe RC-LH114-W.
(A) Protéine-W, oyo etali interface na LH1αβ14 na ndenge ya dessin animé, ezali na monyololo ya mopanzi oyo ezali lokola lingenda (rouge), oyo emonisami na eteni moko ya diagramme ya potentiel électrostatique (surface gris transparente na niveau ya contour ya 0,13). (B) Protéine-W oyo emonisami na esika oyo ezali na langi oyo ezali hydrophobe. Bisika ya polar mpe ya charge elakisami na cyan, bisika oyo hydrophobe elakisami na langi ya pembe, mpe bisika oyo hydrophobe makasi elakisami na langi ya orange. (C mpe D) Protéine-W oyo emonisami na dessin animé, orientation na yango ezali ndenge moko na oyo ezali na (A) (C), mpe ebalukaka na 180° (D). Engebene esika oyo ezali na molɔngɔ́, ba résidus oyo ekoki kokesenisa yango ezwa schéma ya langi ya arc-en-ciel, epai N-terminal ezali bleu mpe C-terminal ezali rouge. (E) Protéine-W na ndenge ya kotala ndenge moko na (A), mpe ba résidus oyo ezali na interface ya proteine-W:LH1 elakisami na ba fimbo oyo ezali na bilembo oyo ekangami. (F) Protéine-W ebalukaka 90° par rapport na (E) na LH1αβ14 na représentation ya dessin animé, mpe par rapport na ba résidus ya interface na représentation ya barre. Ba résidus oyo ekangami likolo oyo euti na polypeptide bêta ezali na étiquette. Cofacteur elakisami lokola barre oyo ekokani na langi ya figure 1, β-DDM oyo epanzani elakisami na gris, mpe oxygène elakisami na rouge. (G) Tala oyo ezali na (F) ebalusami na 180°, na ba résidus ya polele ya polypeptide alpha oyo ezali na étiquette.
Protéine-W e remplacer hétérodimère αβ (ya 15 na figure 1F), na yango epekisaka bokangami ya boucle mpe e incliner ba hétérodimères misato ya liboso ya αβ. Emonanaki ete angle ya inclinaison maximale ya hétérodimère ya liboso αβ-1 par rapport na normal ya film ezalaki 25° à 29° (Figure 1, A et E), oyo esalemaki na inclinaison 2° à 8° ya αβ-1 na RC A contraste makasi-LH116 (Figure 1, B et F). Ba hétérodimères ya mibale mpe ya misato ezali incliné na 12° à 22° mpe 5° à 10°, respectivement. Na tina ya epekiseli stérique ya RC, inclinaison ya αβ-1 esangisi te paire ya mibale ya αβ (oyo ekokani na 16e αβ na figure 1F), na yango esali espace clair na bague ya LH1 (Figure 1, A na E) . Na tina ya bozangi ya ba hétérodimères mibale ya αβ, elongo na bobungisi ya BChl minei mpe ba caroténoïdes mibale, moko te ya ba caroténoïdes ekangamaka na sous-unité αβ-1 torsionnée, esali que bague ya LH114-W ezala na ba caroténoïdes 13 Végétariens mpe 28 BChls. Ba estimations ya résolution locale ya ba complexes mibale na ba régions αβ1 à 7 ezali na se koleka oyo ya boucle LH1 oyo etikali, oyo ekoki ko refleter plasticité inhérente ya sous-unité LH1 adjacente na site ya RC QB (Figure 4) .
Bilili ya RC-LH114-W (A pe B) pe RC-LH116 (C pe D) elakisami na ndenge moko na vue ya likolo/vue côté (A pe B) (A pe C) pe surface ya cavité ya Fig. 1. (B pe D). Bafungola ya langilangi emonisami na lobɔkɔ ya mobali.
Complexe mosusu ya moboko oyo ezali na bizaleli mosusu oyo ezali na rapport stoéchiométrique ya 1:14 ezali dimère Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX (13). Kasi, proteine ​​W na PufX ezali na homologie ya polele te, mpe ezali na impact ya monene na ba structures na bango ya LH1 respectives. PufX ezali TMH moko oyo ezali na domaine cytoplasmique N-terminal oyo e interagir na côté cytoplasmique ya sous-unité RC-H (13) na position oyo ekokani na Rps. palustris LH116αβ-16 oyo ezali na kati. PufX esala canal mpo na échange ya quinone/quinolone entre RC-LH1 na complexe cytochrome bcl mpe ezali na Rba nionso. complexe ya noyau ya sphaéroïdes (13). Atako interface monomère-monomère ezali na Rba. Dimère ya sphaéroïdes RC-LH1-PufX ezali na position ya liaison ya proteine ​​W na RC-LH114-W, mpe écart induite na PufX na proteine-W ezali na position équivalent (Figure S7A). Esika oyo ezali na kati ya RC-LH114-W ezali mpe na boyokani na nzela ya quinone hypothétique (8) ya Pseudomonas rosea LH1, oyo esalemi na ba peptides oyo ezali na boyokani te na proteine ​​W to PufX (Figure S7B). En plus, canal ya quinone na Blc. LH1 ya vert émeraude oyo esalemi na kolongolaka sous-unité moko ya γ (7) ezali na esika ya ndenge moko (Figure S7C). Atako esalemi na ba protéines ndenge na ndenge, komonana ya ba canaux quinone/quinolol oyo na position commune na complexe RC-LH1 emonani lokola exemple ya évolution convergente, elakisaka que écart oyo esalemi na proteine ​​W ekoki kosala lokola canaux quinone.
Espace oyo ezali na boucle LH114-W epesaka nzela na formation ya région ya membrane continue entre espace interne ya complexe RC-LH114-W na membrane en masse (Figure 1G), au lieu ya ko relier ba domaines mibale na nzela ya pore ya proteine ​​lokola na ba protéines. Complexe RC-LH116 ekokani na Tch oyo ekangami. Complexe oyo ezali lokola aiguilles (22) (Figure 1H). Lokola bopanzani ya quinone na nzela ya membrane ezali mbangu koleka bopanzani na nzela ya nzela ya proteine ​​ya moke, boucle LH114-W ya polele ekoki kopesa nzela na bozongisi ya RC noki koleka boucle LH116 oyo ekangami, mpe bopanzani ya quinone na kati ya RC ekoki kozala na bopekisami mingi. Pona ko tester soki proteine ​​W ezo affecter conversion ya ba quinones na nzela ya RC, tosalaki test ya oxydation ya cytochrome na concentration moko boye ya ubiquinone 2 (UQ2) (analogue ya UQ10 naturelle na mokila ya isoprène ya mokuse) (Figure 2E). Atako bozali ya quinone chélé epekisaka koyeba na bosikisiki ya constante ya Michaelis oyo emonani (RC-LH114-W mpe RC-LH116 ebongi mpo na 0,2±0.1μM mpe 0,5±0,2μM, respectivement), taux maximum ya RC-LH114-W ( 4,6±0,2 e-RC-1 s-1) ezali 28±5% monene koleka RC-LH116 (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
Tokanisaki na ebandeli ete proteine-W ezali na soki 10% ya complexe ya moboko ( 16 ); awa, ba taux ya occupation ya ba cellules ya croissance ya lumière moke, ya lumière moyenne, pe ya lumière makasi ezali 15±0,6%, 11±1% pe 0,9±0,5, respectivement % (Figure 2F). Comparaison quantitative ya spectrométrie de masse elakisaki que kobakisa étiquette ya histidine ekitisaki te ebele ya relative ya proteine-W soki tokokanisi yango na ba souches ya type sauvage (P = 0,59), yango wana ba niveaux oyo ezali artifact ya proteine-W modifié te (Figure S10). Kasi, occupation oyo ya moke ya proteine-W na complexe RC-LH1 ekoki ko permettre ba RC mosusu e flip na vitesse accéléré, na yango ko mitiger échange ya quinone/quinolone ya malembe na complexe RC-LH116. Tomoni ete taux ya occupation ya lumière ya likolo ezali na boyokani te na ba données ya transcriptomique oyo euti kosalema, oyo elakisaka que expression ya gène pufW emati na se ya lumière makasi (Figure S11) (23). Bokeseni kati na transcription ya pufW mpe bokɔti ya proteine-W na kati ya complexe RC-LH1 ezali kobulunganisa mpe ekoki komonisa régulation complexe ya proteine.
Na RC-LH114-W, 6 cardiolipine (CDL), 7 phosphatidylcholine (POPC), 1 phosphatidylglycérol (POPG) mpe 29 molécules β-DDM epesameli mpe e modeler na kati na yango 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG mpe 12 βDDM. RC-LH116 (Elili 5, A mpe B). Na ba structures oyo mibale, CDL ezali presque na côté cytoplasmique ya complexe, alors que POPC, POPG na β-DDM ezali mingi mingi na côté luminal. Ba molécules mibale ya lipide mpe ya detergent e isolé na région αβ-1 à αβ-6 ya complexe RC-LH114-W (Figure 5A), mpe mitano e isolé na région équivalent ya RC-LH116 (Figure 5B ). Ba lipide mingi ezwamaki na ngambo mosusu ya complexe, mingimingi CDL, oyo eyanganaki kati na RC mpe αβ-7 kino na αβ-13 (Figure 5, A mpe B). Ba lipide mpe ba détergents misusu oyo esili na structurement ezali libanda ya bague ya LH1, mpe ba chaînes acyliques oyo e résoudre malamu epanzani kati na ba sous-unités ya LH1, oyo epesameli nkombo β-DDM na RC-LH114-W, mpe elimbolami lokola β-DDM na RC A mélange ya β-DDM mpe POPC-LH116. Ba positions ya ndenge moko ya ba lipide chélants na ba détergents na structure na biso ezo lakisa que ezali ba sites ya liaison physiologiquement pertinents (Figure S12A). Ba positions ya ba molécules équivalentes na Tch ezali pe na consistance ya bien. Doux mpe Trv. Souche 970 RC-LH1s (Figure S12, B à E) (9, 12) mpe ba résidus ya liaison hydrogène ya groupe ya tête ya lipide elakisaki conservation assez bonne na alignment ya séquence (Figure S13), elakisaka que CDL Conservé oyo ekangamaka na RC (24), ba sites oyo ekoki kozala conservé na complexe RC-LH1.
(A mpe B) Ba peptides RC-LH114-W (A) mpe RC-LH116 (B) elakisami na ba dessins animés, mpe ba pigments elakisami na ba fimbo, na kosaleláká schéma ya langi oyo ezali na elilingi 1. Ba lipide elakisami na langi ya motane, mpe ba détergents elakisami na langi ya motane. UQ oyo ekangami na bisika ya RC QA mpe QB ezali jaune, nzokande UQ isolé ezali bleu. (C mpe D) Makanisi ndenge moko na (A) mpe (B), na ba lipide oyo elongolami. (E kino G) Botali ya monene ya Q1(E), Q2(F) mpe Q3(G) uta na RC-LH116, na minyɔlɔlɔ ya mipanzi oyo ezali na bopusi moko na mosusu. Ba liaisons hydrogènes elakisami lokola ba lignes pointillées noires.
Na RC-LH116, RC QA mpe QB UQ, oyo esanganaka na transfert ya électrons na processus ya séparation ya charge, e décomposé na ba sites na yango ya liaison. Kasi, na RC-LH114-W, QB quinone esili te mpe ekolobama na bozindo na nse. En plus ya ba quinones QA na QB, ba molécules mibale ya UQ chélées (ezwami kati ya ba bague RC na LH1) ekabolami na structure ya RC-LH114-W selon ba groupes na bango ya tête bien résolution (ezwami na Q1 na Q2, respectivement). esika). Figure 5C). Ba unité mibale ya isoprène epesameli na Q1, mpe carte ya densité e résoudre mikila 10 ya isoprène mobimba ya Q2. Na structure ya RC-LH116, ba molécules misato ya UQ10 chélées (Q1 kino Q3, Figure 5D) esili, mpe ba molécules nionso ezali na densité ya polele na mokila mobimba (Figure 5, D kino G). Na ba structures mibale, ba positions ya ba groupes ya tête quinone ya Q1 na Q2 ezali na consistance excellente (Figure S12F), pe e interagir kaka na RC. Q1 ezali na esika ya bokoti ya esika ya W ya RC-LH114-W (Figure 1G pe 5, C, D pe E), pe Q2 ezali pene ya esika ya bokangami ya QB (Figure 5, C, D) pe F). Ba résidus L-Trp143 na L-Trp269 oyo ebatelami ezali pene mingi na Q1 na Q2 mpe epesaka ba interactions potentielles ya π-stacking (Figure 5, E na F, mpe Figure S12). L-Gln88, 3,0 Å na oxygène distal ya Q1, epesaka bokangami makasi ya hydrogène (Figure 5E); résidu oyo ebatelami na ba RC nionso longola se boyokani oyo ezali mosika mingi (Figure S13). L-Ser91 ezali na esika ya Thr na ndenge ya conservateur na ba RC mingi mosusu (Figure S13), ezali 3,8 Angstroms uta na oxygène méthyl ya Q1, mpe ekoki kopesa ba liaisons hydrogènes ya bolembu (Figure 5E). Q3 emonani lokola ezali na interaction spécifique te, kasi ezali na région hydrophobe entre sous-unité RC-M na sous-unité LH1-α 5 à 6 (Figure 5, D et G). Q1, Q2 mpe Q3 to ba quinones chélées oyo ezali pene wana esili mpe kosilisa na Tch. Na boboto, Trv. Souche 970 na Blc. Struktur ya iris (9, 10, 12) ezali kolakisa esika ya bokangami ya quinone auxiliaire oyo ebatelami na complexe RC-LH1 (Figure S12G). Ba UQ mitano oyo epanzani na RC-LH116 ezali na boyokani malamu na 5,8±0,7 ya complexe moko moko oyo ezuami na chromatographie liquide ya performance ya likolo (HPLC), nzoka nde ba UQ misato oyo epanzani na RC-LH114-W ezali na se koleka Valeur mesurée ya 6,2±0,3 (Fig. S14) elakisi ete ezali na ba molécules ya UQ oyo esili te na structure.
Ba polypeptides L na M pseudo-symétriques moko na moko ezali na ba TMH mitano mpe esalaka hétérodimère oyo esangisaka dimère moko ya BChl, ba monomères mibale ya BChl, ba monomères mibale ya bactériophages (BPh), mpe fer moko oyo ezali ya Heme te mpe molécules moko to mibale ya UQ10. Na nzela ya bozali ya ba liaisons hydrogènes na groupe cétone terminal mpe accumulation na yango eyebani na Rps, ba caroténoïdes ekotisami na sous-unité M, oyo bapesaki kombo cis-3,4-déhydroorhodopine. Lolenge ya banyama (25). Domaine ya membrane ya libanda ya RC-H ekangami na membrane na TMH moko. Bokeli ya RC mobimba ekokani na ba sous-unité misato RC ya ba espèces oyo ezali na boyokani (lokola Rba). ba sphaéroïdes (ID ya PDB: 3I4D). Ba macrocycles ya BChl na BPh, mokuwa ya mokɔngɔ ya caroténoïde mpe fer non héme ezo superposer na kati ya intervalle ya résolution ya ba structures oyo, ndenge moko na groupe ya tête UQ10 na esika ya QA mpe quinone QB na RC-LH116 (Figure S15).
Bozali ya ba structures RC mibale oyo ezali na ba taux ya occupation ya site QB ekeseni epesi libaku ya sika ya kotala ba changements conformationnels constants oyo ezo accompagner liaison ya quinone ya QB. Na complexe RC-LH116, quinone QB ezali na position “proximale” oyo ekangami mobimba (26), kasi bokabwani ya RC-LH114-W ezali na quinone QB te. Quinone QB ezali te na RC-LH114-W, oyo ezali kokamwa mpo complexe ezali active, mingi koleka complexe RC-LH116 na quinone QB structurellement résolution. Atako ba rings mibale ya LH1 e chélater soki ba quinones motoba, mitano e résoudre structurellement na bague RC-LH116 oyo ekangami, alors que kaka misato nde ezali structurellement limitée na bague RC-LH114-W ya polele . Bomati oyo ya trouble structurel ekoki kolakisa bozongisi ya mbangu ya ba sites ya RC-LH114-W QB, cinétique ya quinone ya mbangu na complexe, mpe bomati ya probabilité ya kokatisa boucle ya LH1. Tozali kopesa likanisi ete bozangi ya UQ na esika ya RC QB ya RC-LH114-W ekoki kozala mbano ya complexe moko ya mindondo mingi mpe ya mosala mingi, mpe esika ya QB ya RC-LH114-W ekangami mbala moko na bozongisi ya UQ Etape spécifique (entrée na esika ya QB ekangami) ezali kolakisa conformation ya mosala oyo.
Soki QB ezali te, rotation oyo elandi ya L-Phe217 na position oyo ezali incompatible na liaison ya UQ10, po ekosala collision spatiale na unité isoprène ya liboso ya mokila (Figure 6A). En plus, ba changements conformationnels principales évidents ezali évidents, surtout hélice de (hélice ya mokuse na boucle entre TMH D na E) esika L-Phe217 e déplacé na poche ya liaison QB na rotation ya L-Tyr223 (Figure 6A ) Pona kobuka liaison hydrogène na cadre M-Asp45 pe kokanga entrée ya site ya liaison QB (Elilingi 6B). Hélix de pivots na base na yango, Cα ya L-Ser209 e déplacé na 0,33Å, alors que L-Val221Cα e déplacé na 3,52Å. Ezali na mbongwana moko te oyo ekoki komonana na TMH D mpe E, oyo ekoki kozala superposé na ba structures nionso mibale (Figure 6A). Na ndenge toyebi, oyo ezali structure ya liboso na RC naturelle oyo ekangaka esika ya QB. Kokokanisa na structure complete (QB-bound) ezo lakisa que avant que quinone ekita, changement conformationnel esengeli po ekota na quinone. L-Phe217 ebalukaka mpo na kosala interaction ya π-stacking na groupe ya tête ya quinone, mpe hélice ebalukaka libanda, epesaka nzela na skeleton ya L-Gly222 mpe chaîne latérale ya L-Tyr223 esala réseau ya liaison hydrogène na structure ya liaison hydrogène stable (Figure 6, A mpe C).
(A) Dessin animé oyo ezali kozipa ya hologramme (monyololo L, monyololo ya orange/M, magenta) mpe structure apo (gris), oyo kati na yango ba résidus clés elakisami na lolenge ya elilingi oyo ezali lokola lingenda. UQ10 ezali komonisama na barre ya jaune. Line oyo ezali na ba points ezali kolakisa ba liaisons hydrogènes oyo esalemi na structure mobimba. (B mpe C) Représentation ya surface ya apolipoprotéine mpe structure ya bague mobimba, ko souligner oxygène ya chaîne latérale ya L-Phe217 na bleu mpe L-Tyr223 na rouge, respectivement. Sous-unité L ezali na langi ya orange; ba sous-unités M na H ezali na couleur te. (D mpe E) Ba sites ya RC QB ya apolipoprotéine (D) mpe mobimba (E) [langi na (A) respectivement] mpe Thermophilus thermophilus PSII (vert, bleu na quinone ya plastique; ID PDB: 3WU2) Align (58).
Na mbalakaka, atako ba structures ebele ya ba RC oyo ezangi QB sans LH1 ezali, ba changements conformationnels oyo emonanaki na études oyo elobamaki liboso te. Yango esangisi structure ya dépletion ya QB oyo ewutaka na Blc. viridis (ID ya PDB: 3PRC) (27), Tch. tepidum (ID ya PDB: 1EYS) (28) mpe Rba. sphaéroïdes (PDB ID: 1OGV) (29), oyo nyonso ezali pene na ndenge moko na structure QB na yango mobimba. Inspection ya proche ya 3PRC emonisaki que ba molécules ya détergent LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) ekangamaka na entrée ya position QB, oyo ekoki kopekisa réarrangement na conformation fermée. Atako LDAO epɔlaka te na esika moko na 1EYS to 1OGV, ba RC oyo ebongisami na kosalelaka detergent moko mpe na yango ekoki kobimisa effet moko. Bokeli ya cristal ya Rba. Sphaeroides RC co-crystallisé na cytochrome c2 (PDB ID: 1L9B) emonani mpe ete ezali na esika ya QB oyo ekangami. Kasi, na cas oyo, région N-terminale ya polypeptide RC-M (interactant na site ya liaison QB na nzela ya liaison H ya résidu Tyr na hélice Q) e adopter conformation non naturelle, mpe changement conformationnel ya QB e exploré lisusu te (30 ). Oyo ezali ko rassurer ezali que tomoni te lolenge oyo ya déformation ya polypeptide M na structure ya RC-LH114-W, oyo ezali presque ndenge moko na région N-terminale ya RC-LH116 RC. Esengeli mpe koyeba ete sima ya kosilisa antenne LH1 oyo esalemi na détergent, ba RC ya apolipoprotéines na PDB esili, oyo elongolaki ba piscines ya quinone ya kati mpe ba lipide na esika oyo ezali kati na RC mpe surface ya kati ya bague LH1 oyo ezali zingazinga (31, 32). RC etikalaka na mosala mpo ebatelaka ba cofacteurs nionso, longola se quinone QB oyo ekoki kopɔla, oyo ezali stable mingi te mpe mbala mingi ebunga na tango ya procédé ya préparation (33). En plus, eyebani que kolongolama ya LH1 na ba lipide cycliques naturelles na RC ekoki kozala na impact na ba fonctions, lokola durée ya vie ya état P+QB oyo ekabwani na charge ( 31 , 34 , 35 ). Na yango, tozali kokanisa ete bozali ya lopɛtɛ ya LH1 ya esika oyo ezingi RC ekoki kobatela esika ya QB oyo “ekangamaki”, na yango kobatela esika ya esika oyo ezali pene na QB.
Atako apolipoprotéine (kozanga quinone QB) mpe structure mobimba ezali komonisa kaka ba instantanés mibale ya rotation ya esika ya QB, na esika ya kozala na série ya ba événements, ezali na ba indications que liaison ekoki kozala gaté mpo na kopekisa reliaison na hydroquinone Pona kopekisa inhibition ya substrat. Interaction ya quinolol na quinone pene na site QB ya apolipoprotéine ekoki kozala ndenge mosusu, oyo ememaka na rejection na yango na RC. Banda kala, ba proposer que ba changements conformationnels ezo jouer rôle na liaison pe réduction ya ba quinones. Likoki ya ba RC congelées ya kokitisa ba quinones sima ya adaptation ya molili ebebi (36); Crystallographie à rayons X emonisi ete mbeba oyo euti na ba quinones QB oyo ekangami na conformation « distal » soki 4,5 Å na position proximale active (26) , 37). To proposer que conformation oyo ya liaison distal ezali instantané ya état intermédiaire entre apolipoprotéine na structure ya bague mobimba, oyo elandi interaction ya liboso na quinone na ouverture ya site QB.
RC ya type II oyo ezwami na complexe PSII ya bactérie phototrophiques mosusu mpe ba cyanobactéries, ba algues mpe ba plantes ezali na conservation structurelle mpe fonctionnelle (38). Alignment structurel oyo elakisami na figure 6 (D na E) ezo souligner bokokani kati ya ba RC PSII na site QB ya complexe RC bactérien. Kokokanisa yango banda kala ezali ndakisa mpo na koyekola ba systèmes oyo ezali na boyokani makasi ya bokangami mpe kokitisa quinone. Ba publications ya kala epesaki likanisi ete ba changements conformationnels ezali accompagné na réduction ya PSII ya ba quinones ( 39 , 40 ). Na yango, soki totali bobateli ya évolutionnaire ya RC, mécanisme oyo ya bokangami oyo emonanaki liboso te ekoki pe kosalelama na esika ya QB ya PSII RC na ba plantes phototrophiques oxygénées.
Ba souches ya Rps ΔpufW (deletion ya pufW sans marquée) na PufW-His (protéine-W marquée na His 10x C-terminal oyo e exprimer à partir ya locus pufW naturel). palustris CGA009 elobelamaki na mosala na biso ya kala (16). Ba souches oyo mpe moboti isogénique ya type sauvage ezwamaki na congélateur na kosala ba streaking ya motango moke ya ba cellules na PYE (chaque 5 g litres -1) (ebombamaki na LB na -80 °C, oyo ezalaki na 50% ( poids/v) ya proteine ​​ya glycérol), extrait ya levure mpe succinate) plaque ya agar [1,5% (poids/v)]. Plaque e incuber butu mobimba na molili na température ambiante na conditions anaérobie, mpe sima engengisamaki na lumière ya pembe (~50 μmolm-2 s-1) oyo epesami na ba ampoules halogènes OSRAM 116-W (RS Components, UK) na boumeli ya mikolo 3 to 5 kino colonie moko ekobima. Basalelaki colonie moko mpo na ko inoculer 10 ml ya milieu M22+ (41) oyo ebakisami na 0,1% (poids/v) ya ba acides casamino (oyo tokobenga na sima M22). Culture ekolisami na conditions ya oxygène ya moke na molili na 34°C na koningana na 180 rpm na boumeli ya 48 heures, mpe sima 70 ml ya culture e inoculer na conditions moko na boumeli ya 24 heures. Culture semi-aérobie na volume ya 1 ml esalelamaka pona ko inoculer 30 ml ya milieu M22 na molangi ya verre transparent ya 30 ml universel ya likolo ya vis pe ezo irradier na agitation (~50μmolm-2 s-1) pendant 48 heures na force magnétique stérile Tige ya kobalusa. Na sima 30 ml ya culture e inoculer na soki 1 litre ya culture na ba conditions moko, oyo sima esalelamaki pona ko inoculer soki 9 litres ya culture éclairé na ~200 μmolm-2 s-1 pendant 72 heures. Ba cellules ezuami na centrifugation na 7132 RCF na boumeli ya 30 minutes, e resuspendu na ~10 ml ya 20 mM tris-HCl (pH 8.0), mpe ebombamaki na -20°C kino esengeli.
Nsima ya kozindisa, bakisa mwa ba cristaux ya désoxyribonucléase I (Merck, Royaume-Uni), lysozyme (Merck, Royaume-Uni) mpe ba tablettes mibale ya inhibiteur ya protease ya holoenzyme ya Roche (Merck, Royaume-Uni) na ba cellules oyo ezongisami na suspendu. Na cellule ya pression française ya 20.000 psi (Aminco, États-Unis), baselile yango ebebisamaki mbala 8 to 12. Nsima ya kolongola baselile oyo ebukani te mpe biloko oyo ekoki kopɔla te na nzela ya centrifugation na 18.500 RCF na boumeli ya miniti 15 na 4°C, membrane ekɔtaki na lysate pigmenté na nzela ya centrifugation na 113.000 RCF na boumeli ya ngonga 2 na 43.000°C. Bwaka fraction soluble mpe resuspender membrane ya couleur na 100 à 200 ml ya 20 mM tris-HCl (pH 8,0) mpe homogénéiser tii tango ba agrégats oyo emonanaka te. Membrane suspendue e incuber na 20 mM tris-HCl (pH 8,0) (Anatrace, USA) oyo ezalaki na 2% (poids/v) ya β-DDM na boumeli ya ngonga moko na molili na 4°C na koningana na malembe. Na sima centrifuge na 70°C mpo na ko dissoudre 150.000 RCF na 4°C pendant 1 heure mpo na kolongola ba insolubles oyo etikali.
Membrane solubilisante oyo ewutaki na souche ΔpufW esalemaki na colonne ya échange d’ions DEAE Sepharose ya 50 ml na ba volumes misato ya colonne (CV) ya tampon ya liaison [20 mM tris-HCl (pH 8,0) oyo ezali na 0,03% (poids / v) β-DDM]. Sukola colonne na ba tampons mibale ya bokangami ya CV, mpe na sima sukola colonne na ba tampons mibale ya bokangami oyo ezali na 50 mM NaCl. Complexe RC-LH116 e elué na gradient linéaire ya 150 à 300 mM NaCl (na tampon ya liaison) na 1,75 CV, mpe complexe ya liaison oyo etikali e eluer na tampon ya liaison oyo ezalaki na 300 mM NaCl na 0,5 CV. Sangisa spectre ya absorption entre 250 na 1000 nm, bomba fraction na rapport ya absorbance (A880/A280) koleka 1 na 880 à 280 nm, diluer yango mbala mibale na tampon ya liaison, pe salela lisusu procédure moko na colonne DEAE Na purification. Diluer ba fractions oyo ezali na rapport A880/A280 oyo eleki 1,7 mpe na rapport A880/A805 eleki 3,0, sala tour ya misato ya échange d’ions, mpe bobatela ba fractions oyo ezali na rapport A880/A280 eleki 2,2 mpe na rapport A880/A805 eleki 5,0. Complexe oyo epɛtolami ndambo ekómaki na ~2 ml na filtre centrifugal ya Amicon 100.000 oyo ekatamaki na poids moléculaire (MWCO) (Merck, UK), mpe ekɔtisamaki na colonne d’exclusion ya taille Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, US) oyo ezalaki na tampon ya NaCl 200 mM, mpe na nsima elongolamaki na tampon moko na 1,5 CV. Sangisa ba spectres ya absorption ya fraction ya exclusion ya taille, pe ko concentrer ba spectres ya absorption na ba rapports A880/A280 likolo ya 2,4 pe ba rapports A880/A805 likolo ya 5,8 à 100 A880, pe salela yango mbala moko pona préparation to stockage ya grille cryo-TEM Bomba na -80°C tii tango ekosenga.
Membrane solubilisante oyo ewutaki na souche PufW-His esalemaki na colonne ya 20 ml ya HisPrep FF Ni-NTA Sepharose (20 mM tris-HCl (pH 8,0) oyo ezali na 200 mM NaCl mpe 0,03% (poids/poids)) na tampon IMAC ( GE Healthcare). v) β-DDM] oyo ezali na kati. Kolona esukolamaki na ba CV mitano ya tampon IMAC, mpe na nsima na CV mitano ya tampon IMAC oyo ezalaki na histidine 10 mM. Complexe ya noyau e elué na colonne na ba tampons IMAC mitano oyo ezalaki na histidine ya 100 mM. Fraction oyo ezali na complexe RC-LH114-W e concentré na ~10 ml na réservoir oyo ebalusami oyo ezali na filtre Amicon 100.000 MWCO (Merck, UK), e dilué mbala 20 na tampon ya liaison, mpe sima ebakisami na 25 ml Na colonne DEAE Sepharose, ba CV minei oyo ekangami na tampon esalemi liboso. Sukola colonne na ba tampons minei ya bokangami ya CV, sima ko eluer complexe na ba CV mwambe na gradient linéaire ya 0 à 100 mM NaCl (na tampon ya liaison), mpe ba CV minei oyo etikali oyo ezali na tampon ya liaison 100 mM Ba complexes résiduels elués na chlorure de sodium esangani na rapport A880/A280 oyo eleki 2,4 mpe ba Ratio A880/A805 oyo eleki 4,6 fractions e concentré na ~2 ml na filtre centrifugal Amicon 100.000 MWCO, mpe etondisami na 1,5 CV IMAC liboso Buffer équilibré Superdex 200 16/600 taille colonne ya exclusion, mpe sima e elué na tampon moko na 1,5 CV. Bosangisa ba spectres ya absorption ya ba fractions ya taille-exclusion pe bosangisa ba spectres ya absorption na ba rapports A880/A280 likolo ya 2,1 pe ba rapports A880/A805 likolo ya 4,6 à 100 A880, oyo esalelamaka mbala moko pona préparation ya grille TEM congelé to ebombami na -80°C tii tango esengeli.
Basalelaki congélateur d’immersion Leica EM GP mpo na kobongisa ba grille TEM ya température moke. Complexe e dilué na tampon IMAC na A880 ya 50, mpe sima 5μl e charger na maille ya cuivre oyo ewutaki ko décharger glow 1.2/1.3 (Agar Scientific, UK). Incuber grille na 20°C mpe 60% ya humidité relative pendant 30 s, sima effacer yango sec pendant 3 s, et puis boma yango na éthane liquide na -176°C.
Ba données ya complexe RC-LH114-W e enregistrer na eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) na microscope Titan Krios, oyo esalaka na tension accélératrice ya 300kV, na magnification nominal ya 130.000× mpe énergie ya- Pona espace ya 20 eV. Gatan 968 GIF Quantum na détecteur ya sommet K2 esalelamaki mpo na ko enregistrer bilili na mode ya comptage mpo na kosangisa ba données. Taille ya pixel calibré ezali 1,048Å, mpe taux ya dose ezali 3,83 e-Å-2s-1. Asangisaki filme yango na segɔnde 11 mpe akabolaki yango na biteni 40. Salelá esika oyo batyá carbone mpo na kozongisa microscope na esika na yango, mpe na nsima sangisa bafilme misato na libulu moko. Na mobimba, ba films 3130 ezwamaki, na ba valeurs ya défocus entre -1 na -3μm.
Ba données ya complexe RC-LH116 ezuami na nzela ya microscope moko na Laboratoire ya Biostructure ya Asterbury (Université ya Leeds, Royaume-Uni). Ba données ezuami na mode ya comptage na magnification ya 130 k, mpe taille ya pixel e calibré na 1,065 Å na dose ya 4,6 e-Å-2s-1. Bakangaki filme yango na segɔnde 12 mpe bakabolaki yango na biteni 48. Na mobimba, ba films 3359 ezwamaki, na ba valeurs ya défocus entre -1 na -3μm.
Traitement nionso ya ba données esalemaka na pipeline ya Relion 3.0 (42). Salelá Motioncorr 2 (43) mpo na kobongisa mouvement ya faisceau na poids ya dose, mpe na sima salelá CTFFIND 4.1 (44) mpo na koyeba paramètre CTF (fonction ya transfert ya contraste). Ba photomicrographes typiques sima ya ba étapes oyo ya traitement ya liboso elakisami na figure 2. S16. Modèle ya boponi automatique esalemi na kopona na maboko pene na 250 pixels ya 1000 particules na cadre ya 250 pixels mpe classification ya deux dimensions (2D) ya référence te, na yango koboya ba classifications wana oyo ekokisaka contamination ya échantillon to ezali na ba caractéristiques discernibles te. Na nsima, basalaki koponama ya automatique na ba microphotographes nyonso, mpe RC-LH114-W ezalaki na ba particules 849.359, mpe complexe RC-LH116 ezalaki na ba particules 476.547. Ba particules nionso oyo eponami esali ba tour mibale ya classification 2D non référence, pe sima ya course moko na moko, ba particules oyo ekutani na esika ya carbone, contamination ya échantillon, ba éléments ya polele te to ba particules oyo ezo superposer makasi eboyami, oyo esali que 772.033 (90,9%) pe 359.678 (75,5%) ) Ba particules esalelamaka pona classification 3D ya RC-LH114-W mpe RC-LH116 na ndenge ya kolandana. Modèle ya référence 3D ya liboso esalemaki na nzela ya méthode ya bokiti ya gradient stochastique. Na kosalelaka modèle ya ebandeli lokola référence, ba particules oyo eponami e classifié na ba catégories minei na 3D. Kosalela modèle oyo ezali na catégorie oyo lokola référence, sala raffinage 3D na ba particules oyo ezali na catégorie ya munene, sima salela filtre ya passe bas ya 15Å ya liboso pona ko couvrir zone ya solvant, bakisa 6 pixels ya ba bords doux, pe ko post-processer ba pixels pona ko corriger fonction ya transfert ya Modulation ya sommet ya Gatan K2 ya détecteur ya likolo. Pona ensemble ya ba données RC-LH114-W, modèle oyo ya liboso e modifier na kolongola densité makasi na ba bords ya masque (déconnecté na densité complexe ya noyau na Chimera ya UCSF). Ba modèles oyo ezuami (ba résolutions ya RC-LH114-W na RC-LH116 ezali 3,91 na 4,16 Å, respectivement) esalelami lokola référence pona deuxième tour ya classification 3D. Ba particules oyo esalelami esangisi na classe 3D ya ebandeli pe ezali na corrélation makasi te na quartier. Kozipa to kozanga makambo ya polele ya structure. Sima ya tour ya mibale ya classification 3D, catégorie oyo ezali na résolution ya likolo eponami [Po na RC-LH114-W, catégorie moko ezali 377.703 particules (44,5%), pona RC-LH116, ezali na ba catégories mibale, oyo esangisi 260.752 particules (54,7%) , Epayi wapi ezali ndenge moko kaka soki e aligné sima ya rotation ya liboso na bokeseni moke]. Ba particules oyo eponami elongolamaka lisusu na kati ya sanduku ya 400 pixels mpe epɛtolami na nzela ya raffinage 3D. Masque ya solvant esalemi na nzela ya filtre ya passe bas ya 15Å ya ebandeli, expansion ya carte ya 3 pixels mpe masque doux ya 3 pixels. Na kosalelaka refinement ya CTF par particule, correction ya mouvement par particule mpe tour ya mibale ya refinement ya CTF par particule, refinement 3D, masquage en solvant mpe post-traitement esalemaka sima ya étape moko na moko mpo na ko refiner lisusu texture oyo ezuami. Na kosalelaka valeur ya coupe FSC (Coefficient de corrélation ya coquille de Fourier) ya 0,143, ba résolutions ya ba modèles finals ya RC-LH114-W na RC-LH116 ezali 2,65 na 2,80Å, respectivement. Courbe FSC ya modèle final elakisami na figure 2. S17.
Ba séquences nionso ya proteine ​​ezuami na UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; ID ya UniProt: Q6N9L4); RC-L (PufL; ID ya UniProt: O83005); RC-M (PufM; ID ya UniProt: A0A4Z7); RC-H (PuhA; ID ya UniProt: A0A4Z9); Protéine-W (PufW; ID ya UniProt: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) esalemaki mpo na kotonga modèle ya homologie ya RC, oyo ezali na ba séquences ya proteine ​​ya RC-L, RC-M mpe RC-H mpe structure cristalline ya Rba. sphaeroides RC esalemaki lokola modèle (PDB ID: 5LSE) (46). Salelá esaleli ya “kobongisa karte” na Chimera ya UCSF mpo na kokokanisa modèle oyo esalemi na karte (47), kobongisa structure ya proteine, mpe cofacteur [4×BChl a (nkombo ya résidu ya bibliothèque ya monomère = BCL), 2×BPh a (BPH), lolenge moko to mibale ya UQ10 (U10), fer moko oyo ezali héme te (Fe) mpe 3,4-dihydrohexacarbonylcholine moko (QAK)] kosalela Coot (48) mpo na kobakisa. Lokola QAK ezali te na bibliothèque ya monomère, e paramétrisé na nzela ya outil eLBOW na PHENIX (49).
Na nsima, batongaki sous-unité LH1. Na ebandeli, esaleli ya botongi automatique na PHENIX (49) esalelamaki mpo na kotonga automatiquement eteni ya séquence ya LH1 na kosalelaka carte mpe ba séquences ya proteine ​​LH1-α mpe LH1-β lokola entrée. Pona sous-unité ya LH1 oyo eleki mobimba, bimisa yango pe ko charger yango na Coot, bakisa na maboko séquence oyo ezangi na kati, pe ko refiner na maboko structure mobimba avant ya kobakisa deux BCls a (BCL) na spirilloxanthin (CRT) [engebene na Rps oyo etali Densité ya complexe LH1 pe teneur ya caroténoïde oyo eyebani. Lolenge ya banyama (17)]. Kopi ya sous-unité LH1 mobimba, mpe salela “Esaleli ya karte ya docking” ya Chimera ya UCSF mpo na kokangama na esika oyo ezali pembeni ya densité ya LH1 oyo ezali modèle te, mpe na nsima kobongisa yango na Coot; zongela procédé tii tango ba sous-unités nionso ya LH1 ekozala modèle. Pona structure ya RC-LH114-W, na kobimisa densité oyo epesameli te na Coot, proteine ​​e segmenter na ba composants non proteines oyo etikali na carte ya USCF Chimera pe esaleli ya Autobuild esalelami pona ko établir modèle ya liboso, pe ba sous-unités oyo etikali (protéine-W) Modeling. Na PHENIX (49) na likambo yango. Bakisa ba séquences nionso oyo ezangi na modèle oyo ezuami na Coot (48), et puis refiner manuellement sous-unité mobimba. Densité oyo etikali oyo epesameli te ekokani na bosangani ya ba lipide (ID ya bibliothèque ya monomère PDB ya CDL = CDL, POPC = 6PL mpe POPG = PGT), détergent β-DDM (LMT) mpe ba molécules ya UQ10 (U10). Salelá optimisation PHENIX (49) mpe optimisation manuelle na Coot (48) mpo na ko perfectionner modèle initial complet tii tango ba statistiques ya modèle mpe qualité visuel ya ajustement ekoki kobongisama lisusu te. Na suka, salela LocScale (50) pona ko aiguiser carte locale, pe sima sala ba cycles misusu ebele ya modélisation ya densité non allouée pe optimisation automatique pe manuelle.
Ba peptides, ba cofacteurs mpe ba lipide mpe ba quinones mosusu oyo ekangami na kati ya ba densité na yango moko elakisami na ba figures 1 mpe 2. S18 kino S23. Ba informations statistiques ya modèle final elakisami na tableau S1.
Soki elakisami te, ba spectres ya absorption UV/Vis/NIR ezwamaki na spectrophotomètre Cary60 (Agilent, USA) na ba intervalles ya 1 nm kobanda 250 nm kino 1000 nm mpe tango ya bosangisi ya 0,1s.
Diluer échantillon na cuvette ya quartz na nzela ya 2 mm na A880 ya 1, pe sangisa spectre ya absorption entre 400 na 1000 nm. Ba spectres dichroïques circulaires esangisi na spectropolarimètre Jasco 810 (Jasco, Japon) na ba intervalles ya 1 nm entre 400 nm na 950 nm na vitesse ya scanner ya 20 nm min-1.
Coefficient ya extinction molaire ezuami na ko diluer complexe ya noyau na A880 ya soki 50. Diluer volume ya 10μl na tampon ya liaison 990μl to methanol, pe kosangisa spectre ya absorption mbala moko pona ko minimiser dégradation ya BChl. Contenu ya BChl ya échantillon moko na moko ya methanol e calculer na coefficient ya extinction na 771 nm ya 54,8 mM-1 cm-1, mpe coefficient ya extinction ezuami (51). Kabola concentration ya BChl oyo emesami na 32 (RC-LH114-W) to 36 (RC-LH116) pona koyeba concentration ya complexe ya noyau, oyo sima esalelamaka pona koyeba spectre ya absorption ya échantillon moko oyo ezuami na coefficient ya Extinction ya tampon. ezotalana. Ba mesures misato ya mbala na mbala ezuami pona échantillon moko moko, pe moyenne ya absorbance ya maximum ya BChl Qy esalelamaki pona calcul. Coefficient ya extinction ya RC-LH114-W oyo emesami na 878 nm ezali 3280±140 mM-1 cm-1, nzoka nde coefficient ya extinction ya RC-LH116 oyo emesami na 880 nm ezali 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 e quantifiamaki selon méthode oyo ezali na (52). Na mokuse, HPLC ya phase inverse (RP-HPLC) esalemaki na nzela ya système Agilent 1200 HPLC. Fondu soki 0,02 nmol ya RC-LH116 to RC-LH114-W na 50μl ya 50:50 methanol:chloroforme oyo ezali na chlorure ferrique 0,02% (poids/v), mpe injecter Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm oyo e équilibre liboso na 1 ml-1 min-1 na 40°C na HPLC solvant (80:20 methanol:2-propanol) na colonne ya ×25 cm. Sala élution isocratique na solvant HPLC pona ko suivre absorbance na 275 nm (UQ10), 450 nm (caroténoïdes) na 780 nm (BChl) pendant 1 heure. Sommet na chromatogramme ya 275 nm na 25,5 minutes e intégré, oyo ezalaki na ba composés mosusu oyo ekoki ko détecté te. Etando intégré esalelamaka pona kosala calcul ya quantité molaire ya UQ10 oyo ezuami na référence na courbe ya calibration oyo ezuami na injection ya ba normes ya peto kobanda 0 kino 5,8 nmol (Figure S14). Échantillon moko na moko e analysé na ba replicas misato, mpe erreur oyo elobamaki ekokani na SD ya moyenne.
Solution oyo ezalaki na complexe RC-LH1 na absorption maximale ya Qy ya 0,1 ebongisamaki na 30 μM ya cytochrome c2 ya motema ya cheval réduit (Merck, Royaume-Uni) mpe 0 à 50 μMUQ2 (Merck, Royaume-Uni). Ba échantillons misato ya 1 ml ebongisamaki na concentration moko na moko ya UQ2 mpe e incuber butu mobimba na molili na 4°C mpo na ko assurer adaptation complete na molili avant ya mesure. Solution e chargeaki na spectrophotomètre modulaire OLIS RSM1000 équipé na grille ya 300 nm ya flamme/500 ligne, 1,24 mm ya entrée, 0,12 mm ya milieu na 0,6 mm ya ba fentes ya sortie. Filtre ya passe ya 600 nm etie na entrée ya phototube ya échantillon na tube photomultiplier ya référence pona ko exclure lumière ya excitation. Absorbance ezalaki surveillé na 550 nm na temps ya intégration ya 0,15 s. Pole ya excitation ebimaka na LED ya 880 nm M880F2 (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., Royaume-Uni) na nzela ya câble fibre optique na intensité ya 90% na nzela ya contrôleur DC2200 (Thorlabs Ltd., Royaume-Uni) mpe ebimaka na source ya lumière na angle ya 90° ya. Likonzí ya komeka ezali kotɛmɛla talatala mpo na kozongisa pole nyonso oyo na ebandeli ezwamaki te na échantillon. Monitor absorbance 10 s avant éclairage ya 50 s. Na sima ba suivre lisusu absorbance pendant 60 s na molili pona ko évaluer na ndenge nini quinolol ekitisaka spontanément cytochrome c23 + (tala Figure S8 pona ba données brutes).
Ba données esalemaki na ko fitting vitesse initial linéaire na kati ya 0,5 à 10 s (en fonction ya concentration ya UQ2) pe kosala moyenne ya ba taux ya ba échantillons nionso misato na concentration moko moko ya UQ2. Concentration ya RC-LH1 oyo ezuami na coefficient ya extinction respective esalelamaki pona ko convertir taux na efficacité catalytique, oyo esalemi na tracé na Origin Pro 2019 (OriginLab, USA), pe ekangamaki na modèle Michaelis-Menten pona koyeba ba valeurs apparentes ya Km pe Kcat.
Pona ba mesures ya absorption transitoire, échantillon ya RC-LH1 e dilué na ~2μM na tampon IMAC oyo ezalaki na 50 mM ya ascorbate de sodium (Merck, USA) na 0,4 mM ya Terbutine (Merck, USA). Acide ascorbique esalelamaka lokola mopesi ya électrons sacrifice, mpe tert-butaclofène esalelamaka lokola inhibiteur ya QB mpo na kosala ete mopesi ya RC ya monene atikala ekitisami (elingi koloba, photooxydé te) na boumeli ya mosala mobimba ya bomekoli. Pene na 3 ml ya échantillon ebakisami na cellule oyo ebalukaka na ndenge ya moto ye moko (pene na 0,1 m na diamètre, 350 RPM) na bolai ya nzela ya optique ya 2 mm mpo na kosala ete échantillon oyo ezali na nzela ya laser ezala na ntango ekoki mpo na adaptation ya molili kati na ba pulsations ya excitation. Salelá ba pulsations laser ~100-fs mpo na ko amplifier système laser Ti: Sapphire (Spectra Physics, USA) mpo na ko exciter échantillon na 880 nm na vitesse ya répétition ya 1 kHz (20 nJ mpo na NIR to 100 nJ mpo na Vis). Yambo ya kosangisa ba données, tia échantillon na lumière ya excitation pendant soki 30 minutes. Exposition ekosala que QA ezala inactivation (peut-être ko réduire QA mbala moko to mibale). Kasi tosengi oyeba ete processus oyo ezali reversible mpo sima ya eleko molai ya adaptation ya molili, RC ekozonga malembe malembe na activité ya QA. Basalelaki spectromètre Helios (Ultrafast Systems, États-Unis) mpo na komeka ba spectres transitoires na temps ya retard ya -10 à 7000 ps . Salelá logiciel Surface Xplorer (Ultrafast Systems, États-Unis) mpo na kolongola ba ensembles ya ba données, na nsima kosangisa mpe kosala standard. Salelá logiciel CarpetView (Light Conversion Ltd., Lituanie) mpo na kosalela ensemble ya ba données oyo esangisami mpo na kozwa ba spectres différentiels oyo etali détérioration, to salela fonction oyo e convolver ba exponents ebele na réponse ya instrument mpo na ko correspondre na évolution spectrale ya longueur d’onde moko na Origin (OriginLab, USA).
Ndenge tolobaki yango likoló (53), babongisaki filme moko ya photosynthétique oyo ezalaki na complexe LH1 oyo ezangi antenne ya RC mpe ya LH2 périphérique. Ba dilué membrane na tris ya 20 mM (pH 8,0) mpe sima ba chargeaki yango na cuvette ya quartz na nzela ya optique ya 2 mm. Pulse ya laser ya 30nJ esalemaki mpo na ko exciter échantillon na 540 nm na temps ya retard ya -10 à 7000 ps. Bosala ensemble ya ba données ndenge elobami pona Rps. pal échantillon.
Membrane e pelleté na centrifugation na 150.000 RCF pendant 2 heures na 4°C, et puis absorbance na yango na 880 nm e resuspendu na 20 mM tris-HCl (pH 8,0) na 200 mM NaCl. Fungola membrane na koningisa malembe malembe na 2% (poids/v) ya β-DDM na boumeli ya ngonga 1 na molili na 4°C. Échantillon e dilué na carbonate ya triéthylammonium (pH 8,0) 100 mM (TEAB; Merck, UK) na concentration ya proteine ​​ya 2,5 mg ml-1 (analyse Bio-Rad). Traitement mosusu esalemaki na méthode oyo ebimisamaki liboso (54), kobanda na dilution ya 50 μg ya proteine ​​na total ya 50 μl ya TEAB oyo ezali na 1% (poids/v) ya laurate de sodium (Merck, UK). Après sonication pendant 60 s, e réduit na 5 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (Merck, UK) na 37°C pendant 30 minutes. Mpo na S-alkylation, ko incuber échantillon na 10 mM ya méthyl S-méthylthiométhanesulfonate (Merck, UK) mpe bakisa yango na solution stock ya isopropanol ya 200 mM na boumeli ya miniti 10 na température ambiante. Digestion proteolytique esalemaki na kobakisa 2 μg ya mélange ya trypsine/endoprotéinase Lys-C (Promega UK) mpe e incuber na 37°C na boumeli ya 3 heures. Ba extrait surfactant ya laurate na kobakisa 50 μl ya acétate d’éthyle na 10 μl ya acide trifluoroacétique ya grade LC 10% (v/v) (TFA; Thermo Fisher Scientific, Royaume-Uni) mpe kosala vortex na boumeli ya 60 s. Bokabwani ya phase etombolamaki na nzela ya centrifugation na 15.700 RCF na boumeli ya miniti 5. Engebene protocole ya mosali, basalelaki colonne spin C18 (Thermo Fisher Scientific, Royaume-Uni) mpo na ko aspirer na bokebi mpe kolongola mungwa na phase inférieure oyo ezali na peptide. Sima ya kokauka na centrifugation ya vide, échantillon e dissous na 0,5% ya TFA na 3% ya acétonitrile, mpe 500 ng e analysé na chromatographie RP nanoflow couplé na spectrométrie de masse en utilisant ba paramètres ya système oyo e détaillé liboso.
Salelá MaxQuant v.1.5.3.30 (56) mpo na koyeba mpe kopesa motuya ya proteine ​​mpo na koluka Rps. base de données ya protéome ya palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Ba données ya protéomique ya spectrométrie de masse etiemaki na Alliance ProteomeXchange na nzela ya ebombelo ya partenaire PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) na se ya identifiant ya ensemble ya ba données PXD020402.
Pona analyse na RPLC couplé na spectrométrie ya masse ya ionisation électropulvérisation, complexe RC-LH1 ebongisamaki na ba Rps ya type sauvage. Na kosaleláká lolenge oyo ebimisamaki liboso (16), motuya ya proteini oyo ebimisamaki na baselile ya palustris ezalaki 2 mg ml-1 na 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl mpe 0,03% (poids/v) β- (analyse Bio-Rad) ) DDM. Engebene na protocole ya mosali, salela trousse ya purification 2D (GE Healthcare, USA) mpo na kobimisa 10 μg ya proteine ​​na nzela ya méthode ya précipitation, mpe ko dissoudre précipité na 20 μl 60% (v / v) acide formique (FA), 20% (v / v) Acétonitrile mpe 20% (v/v) ya mayi. Microlitres mitano e analysé na RPLC (Dionex RSLC) couplé na spectrométrie de masse (Maxis UHR-TOF, Bruker). Salelá colonne MabPac 1,2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, UK) mpo na kokabola yango na 60°C mpe 100μlmin -1, na gradient ya 85% (v/v) ya solvant A [0,1% (v / v) FA mpe 0,02% (V/v) ya solution aqueuse ya TFA] kino na 85%(v/v) ya solvant B [0,1%(v/v) FA mpe 0,02%(v/v) na 90%(v/v) acétonitrile TFA] Na kosalelaka source ya ionisation ya électropulvérisation standard mpe ba paramètres par défaut na boumeli ya miniti koleka 60, spectromètre ya masse ezuaka 100 kino 2750 m/z (rapport ya masse-charge). Na lisalisi ya portail ya makoki ya bioinformatique ExPASy esaleli FindPept (https://web.expasy.org/findpept/), kosala carte ya spectre ya masse na ba sous-unités ya complexe.
Ba cellules ekolisama na boumeli ya ngonga 72 na se ya 100 ml ya NF-basse (10μMm-2 s-1), moyenne (30μMm-2 s-1) to ya likolo (300μMm-2 s-1) lumière. Moyen M22 (moyen M22 oyo balongoli sulfate d’ammonium mpe ba remplacer succinate de sodium na acétate de sodium) na molangi ya 100 ml oyo ezali na likolo ya vis (23). Na ba cycles mitano ya 30-s, ba perles ya verre ya 0,1 microns e perles na rapport ya volume ya 1:1 pona ko lyser ba cellules pe e chiller na glace na 5 minutes. Matériel insoluble, ba cellules oyo ebukani te mpe ba perles ya verre elongolamaki na centrifugation na 16.000 RCF na boumeli ya 10 minutes na microcentrifugeuse ya banc. Membrane ekabolamaki na rotor Ti 70.1 na 100.000 RCF na 20 mM tris-HCl (pH 8,0) na gradient ya saccharose 40/15% (poids/poids) na boumeli ya ngonga 10.
Ndenge elobamaki na mosala na biso ya kala, immunodetection ya tag His na PufW ( 16 ). Na mokuse, complexe ya noyau purifié (11,8 nM) to membrane oyo ezali na concentration moko ya RC (eyebani na oxydation kolongolaka spectre ya différence réduite mpe ko correspondre na charge na gel coloré) na tampon ya chargement SDS 2x (Merck, UK) dilué mbala mibale. Ba proteines ekabolamaki na gel ya NuPage ya bis-tris 12% ya réplique (Thermo Fisher Scientific, Royaume-Uni). Ba taché gel moko na Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, Royaume-Uni) mpo na ko charger mpe ko visualiser sous-unité RC-L. Protéine oyo ezalaki na gel ya mibale e transféré na membrane ya fluorure de polyvinylidene activé par méthanol (PVDF) (Thermo Fisher Scientific, Royaume-Uni) mpo na immunoessay. Membrane ya PVDF ekangamaki na 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2% (v / v) Tween-20 mpe 5% (poids / v) ya miliki ya poudre déroitée, mpe na sima e incuber na anticorps primaire anti-His (na Diluer tampon ya anticorps [50 mM tris-HCl (pH 7,6),). 150 mM NaCl mpe 0,05% (v/v) Tween-20] na 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) na boumeli ya ngonga 4. Sima ya kosukola mbala 3 na boumeli ya miniti 5 na tampon ya anticorps, basangisaki membrane na anticorps secondaire anti-soso peroxydase (Sigma-Aldrich, Royaume-Uni) (dilué 1:10.000 na tampon ya anticorps) Incuber mpo na ko permettre détection (5 minutes sima ya 3 lavages na tampon ya anticorps) na nzela ya substrat ya chimiluminescence WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, Italie) mpe Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Royaume-Uni).
Na kosala dessin ya distribution ya intensité ya gel coloré to voie immunoessai moko na moko, kosangisa esika oyo ezali na se ya sommet mpe ko calculer rapport ya intensité ya RC-L (gel coloré) na Protéine-W (immunoessay), na ImageJ (57) Processer image. Ba rapports wana ebongwanaki na ba rapports molaire en supposant que rapport ya RC-L na proteine-W na échantillon pure RC-LH114-W ezalaki 1:1 mpe normaliser ensemble ya ba données mobimba en conséquence.
Mpo na biloko ya kobakisa mpo na lisolo oyo, talá http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Oyo ezali lisolo ya accès ouvert oyo ekabolami na se ya mibeko ya Licence ya Attribution ya Creative Commons. Lisolo yango epesi nzela ya kosalela yango, kokabola yango mpe kobimisa yango lisusu kozanga epekiseli na mopanzi-nsango nyonso soki mokanda ya ebandeli etángamaki malamu.
Liyebisi: Tosɛngi yo kaka opesa adresi na yo ya email mpo moto oyo opesi toli na lokasa ayeba ete olingi amona email yango mpe ezali spam te. Tokokanga ata adresse email moko te.
Motuna oyo esalelamaka mpo na komeka soki ozali mopaya mpe kopekisa kotinda ba spam automatique.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Mosali bilanga, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Structure ya haute résolution ya complexe ya piège ya lumière 1 na centre ya réaction epesaka ba insights ya sika na dynamique ya quinone.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Mosali bilanga, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Structure ya haute résolution ya complexe ya piège ya lumière 1 na centre ya réaction epesaka ba insights ya sika na dynamique ya quinone.
©2021 Lisangá ya Amerika mpo na botomboli siansi. makoki nyonso mazali ya yo. AAAS ezali partenaire ya HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef mpe COUNTER. Bokoli ya siansi ISSN 2375-2548.